Eine wichtige Technik für die Untersuchung von Genexpression ist die Verwendung von sogenannten Reportergenen. Dabei handelt es sich um Gene, deren Produkte leicht nachweisbar sind (Farbe, Fluoreszenz etc) und die unter die Kontrolle eines zu untersuchenden Promotors gestellt werden.
In unserem Versuch wurde das Gen für die β-Galaktosidase verwendet um die Funktion des phl-Operons von Pseudomonas putida zu untersuchen. In diesem Operon sind die Gene für den Phenol-Abbau (der über den Meta-Abbauweg erfolgt) kodiert, es wird durch die Anwesenheit von Phenol induziert. Im verwendeten Mutantenstamm befindet sich nun das lacZ-Gen anstelle des zweiten Gens im phl-Operon, es handelt sich um eine Transkriptionsfusion. Durch Phenol sollte hier also die β-Galaktosidase-Produktion induziert werden, was sich farblich nachweisen lässt.
Neben dem Mutanten-Stamm wurde auch der zum Phenol-Abbau fähige Wildtyp-Stamm verwendet, beide wurden in je 2 Ansätz geteilt von denen immer einer mit Phenol versetzt wurde. Die Stämme wurden für 5 Stunden inkubiert, wobei einmal in der Stunde eine Probe entnommen wurde, welche zum Messen der optischen Dichte und der β-Galaktosidase-Aktivität dienten.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1. Ansetzen der Kultur und Messung der optischen Dichte
2.2. Messung der β-Galaktosidase-Aktivität
3. Ergebnisse
3.1. Wachstum der Zellkulturen
3.2. β-Galaktosidase-Aktivität
4. Diskussion
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht die Induktion des phl-Operons von Pseudomonas putida H mithilfe einer Transkriptionsfusion, um die Genexpression unter Einfluss von Phenol zu analysieren. Dabei steht die Frage im Zentrum, ob durch Phenol die β-Galaktosidase-Produktion in einem entsprechenden Mutantenstamm gezielt induziert werden kann.
- Untersuchung von Genexpressionsmechanismen durch Reportergene
- Analyse des Phenol-Abbaus bei Pseudomonas putida
- Einsatz von Transkriptionsfusionen zur Untersuchung von Operon-Funktionen
- Messung der optischen Dichte und Enzymaktivität zur Wachstums- und Induktionskontrolle
Auszug aus dem Buch
1. Einleitung
Eine wichtige Technik für die Untersuchung von Genexpression ist die Verwendung von sogenannten Reportergenen. Dabei handelt es sich um Gene, deren Produkte leicht nachweisbar sind (Farbe, Fluoreszenz etc) und die unter die Kontrolle eines zu untersuchenden Promotors gestellt werden.
In unserem Versuch wurde das Gen für die β-Galaktosidase verwendet um die Funktion des phl-Operons von Pseudomonas putida zu untersuchen. In diesem Operon sind die Gene für den Phenol-Abbau (der über den Meta-Abbauweg erfolgt) kodiert, es wird durch die Anwesenheit von Phenol induziert. Im verwendeten Mutantenstamm befindet sich nun das lacZ-Gen anstelle des zweiten Gens im phl-Operon, es handelt sich um eine Transkriptionsfusion. Durch Phenol sollte hier also die β-Galaktosidase-Produktion induziert werden, was sich farblich nachweisen lässt.
Neben dem Mutanten-Stamm wurde auch der zum Phenol-Abbau fähige Wildtyp-Stamm verwendet, beide wurden in je 2 Ansätz geteilt von denen immer einer mit Phenol versetzt wurde. Die Stämme wurden für 5 Stunden inkubiert, wobei einmal in der Stunde eine Probe entnommen wurde, welche zum Messen der optischen Dichte und der β-Galaktosidase Aktivität dienten.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Einführung in die Methodik der Reportergene und die spezifische Fragestellung zur Untersuchung des phl-Operons von Pseudomonas putida mittels Transkriptionsfusion.
2. Material und Methoden: Beschreibung der Versuchsbedingungen, einschließlich der Zellkulturvorbereitung, Verdünnungsreihen und der Vorgehensweise bei der Messung der optischen Dichte sowie der Enzymaktivität.
3. Ergebnisse: Darstellung der erhobenen Daten zum Zellwachstum und zur β-Galaktosidase-Aktivität, inklusive tabellarischer und grafischer Auswertungen der verschiedenen Versuchsansätze.
4. Diskussion: Interpretation der Messergebnisse unter Berücksichtigung der Phenol-Toxizität, methodischer Fehlerquellen bei der Aktivitätsmessung und kritische Auseinandersetzung mit unerwarteten Ergebnissen.
Schlüsselwörter
Genexpression, Reportergene, β-Galaktosidase, Pseudomonas putida, phl-Operon, Phenol, Transkriptionsfusion, Zelldichte, Enzymaktivität, lacZ-Gen, Induktion, Stoffwechselabbau, Bakterienkultur, Molekularbiologie, Stoffwechselwege
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die Genexpressionsvorgänge und die Induktion des phl-Operons bei dem Bakterium Pseudomonas putida unter dem Einfluss von Phenol.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Die Schwerpunkte liegen auf der Molekularbiologie gramnegativer Bakterien, dem spezifischen Phenol-Abbauweg sowie der Anwendung von Reportergenen zur Funktionsanalyse.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das Ziel ist die Untersuchung der Induktion des phl-Operons mithilfe einer Transkriptionsfusion, wobei das lacZ-Gen als Reporter für die β-Galaktosidase-Aktivität dient.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es wird eine Transkriptionsfusion eingesetzt, bei der stündlich Proben zur Messung der optischen Dichte (Wachstum) und der β-Galaktosidase-Aktivität analysiert werden.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der detaillierten Versuchsdurchführung, der Präsentation der Wachstumskurven und der Berechnung sowie Darstellung der relativen Enzymaktivität in Miller-Einheiten.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Die Arbeit lässt sich am besten durch Begriffe wie Transkriptionsfusion, Pseudomonas putida, Phenol-Abbau, Reportergen-Assay und Enzymkinetik beschreiben.
Warum wurde in diesem Versuch die optische Dichte gemessen?
Die Messung der optischen Dichte diente zur Überwachung des Zellwachstums und zur Normalisierung der β-Galaktosidase-Aktivitätswerte, um die Enzymproduktion auf die Zellzahl zu beziehen.
Welcher Effekt wurde bei der Zugabe von Phenol beobachtet?
Es wurde eine deutliche Abnahme der Zelldichte beobachtet, was auf die Toxizität des Phenols für die verwendeten Bakterienstämme zurückgeführt wird.
Wie lässt sich die unerwartete β-Galaktosidase-Aktivität erklären?
Der Autor vermutet mögliche Fehler bei der Probenbehandlung oder eine fehlerhafte Einstellung der Wellenlänge bei der Photometrie als Ursachen für die unerwartet hohen Werte in den nicht-induzierten Ansätzen.
- Quote paper
- Cornelia Dorn (Author), 2006, Untersuchung der Induktion des phl-Operons von Pseudomonas putida H mit Hilfe einer Transkriptionsfusion, Munich, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/87896
