[...] Eine der effektivsten Möglichkeiten, die genauen Transportmechanismen zu untersuchen, besteht darin, die Trajektorien einzelner Moleküle und Partikel während des Transportes in lebenden Zellen direkt zu visualisieren und quantitativ auszuwerten [Gosh und Webb, 1994; Schmidt et al, 1995; Schütz et al. 1997; Saxton, 1997]. Dies erfordert Untersuchungsmethoden, die keinen Einfluß auf die Struktur und Funktion einer Zelle haben, aber dennoch in der Lage sind , diese real abzubilden und zu analysieren. Das konfokale-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) stellt eine solche nichtinvasive Technik dar, die es erlaubt dreidimensionale, komplexe biologische Proben in vielfältiger Weise, auch mit realer dreidimensionaler Auflösung, abzubilden und zu analysieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die Möglichkeiten eines konventionellen CLSM im Hinblick auf die Detektion von Trajektorien mobiler submikroskopischer Partikel und Moleküle zu definieren.
Die Größe der betrachteten Moleküle und Partikel liegt deutlich unterhalb der Wellenlänge des Lichtes. Das Bild der submikroskopischen Teilchen ist daher eine Airy-Scheibe mit einem Radius von ca. 200 nm, je nach Apertur des Objektivs. Dadurch ist das Auflösungsvermögen des Mikroskopes begrenzt, d.h. Strukturen, die näher zusammenliegen als der Radius der Airy-Scheibe können nicht mehr getrennt dargestellt werden.
In dieser Arbeit wird nun die Tatsache ausgenutzt, daß die Position des Zentrum einer einzelnen Airy-Scheibe – und damit die Position des abgebildeten Partikels – mit einer Genauigkeit lokalisiert werden kann, die weit unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskopes liegen kann. Die Position des Zentrums wird dabei durch einen Fitprozeß bestimmt. Anhand einer statistischen Analyse dieser Fit-Methode wird ein theoretisches Modell entwickelt, das Voraussagen über die Lokalisierungsgenauigkeit des Zentrums erlaubt. Dabei zeigt sich, daß die theoretische Lokalisierungsgenauigkeit nicht nur von den gewählten Aufnahmeparametern (z.B. Objektiv und Bildfeldgröße), sondern maßgeblich vom erzielbaren Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) der Bilder anhängt.
Daher wird ein Überblick über die vorhandenen Rauschquellen des verwendeten Mikroskopes gegeben und ein Modell entwickelt, das eine genaue Definition des SRV zuläßt. Diese Methode wird durch entsprechende Messungen des Rauschens ergänzt und überprüft. [...]
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Das konfokale Laser-Scannning-Mikroskop (CLSM)
- Der Aufbau des Mikroskopes und das konfokale Prinzip
- Die Bildaufnahme
- Die Punktübertragungsfunktion des CLSM
- Die laterale Intensitätsverteilung der Signale
- Die axiale Intensitätsverteilung
- Die Näherung durch eine Gauß-Funktion
- Theorie
- Rauschanalyse der Bilder
- Die Rauschquellen
- Das Photonenrauschen
- Das Rauschen der Sekundärelektronen
- Der Dunkelstrom des Photomultipliers
- Elektronikrauschen
- Das Signal-Rausch-Verhältnis
- Das vereinfachte Rauschmodell
- Nanolokalisierung immobiler submikroskopischer Partikel
- Die Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit
- Definition der Fehlergrenzen für die Fitparameter
- Die Fehler in den Parametern
- Der dreidimensionale Fitprozeß
- Theorie der Brown'schen Bewegung
- Die Langevin'sche Gleichung
- Berechnung des mittleren Verschiebungsquadrates
- Experimentelle Methoden und Ergebnisse
- Charakterisierung der Proben
- Messung der Punktübertragungsfunktion
- Laterale Auflösung
- Axiale Auflösung
- Rauschanalyse
- Bildaufnahme und -analyse
- Bestimmung der Rauschzahl in Abhängigkeit der PMT-Spannung
- Messung der Rauschzahl in Abhängigkeit von der Mittelungszahl
- Nanolokalisierung immobiler submikroskopischer Partikel
- Eindimensionale Messungen
- Dreidimensionale Messungen
- Vergleich der Theorie mit den Messungen an immobilen Partikeln
- Nanolokalisierung mobiler submikroskopischer Partikel
- Aufnahmegeschwindigkeiten
- Eindimensionale Messungen
- Dreidimensionale Messungen
- Vergleich der gemessenen Diffusionskoeffizienten mit theoretischen Werten
- Diskussion
- Rauschanalyse der Bilder
- Lokalisierung submikroskopischer Partikel
- Abweichung zwischen Theorie und Experiment
- Auswirkung des Brechungsindex auf die axiale Lokalisierung
- Grenzen für die Nanolokalisierung von mobilen Partikeln
- Zusammenfassung und Ausblick
- Literaturverzeichnis
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die Diplomarbeit befasst sich mit der Genauigkeit der Lokalisierung submikroskopischer Partikel mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Bildanalyse. Ziel ist es, die Möglichkeiten eines konventionellen CLSM im Hinblick auf die Detektion von Trajektorien mobiler submikroskopischer Partikel und Moleküle zu definieren.
- Rauschanalyse der Bilder und Definition des Signal-Rausch-Verhältnisses (SRV)
- Theoretische Herleitung der Lokalisierungsgenauigkeit von submikroskopischen Partikeln in Abhängigkeit vom SRV und den Aufnahmeparametern
- Experimentelle Bestimmung der Lokalisierungsgenauigkeit immobilen und mobilen Partikeln
- Untersuchung der Brown'schen Bewegung submikroskopischer Partikel und Bestimmung des Diffusionskoeffizienten
- Bewertung der Grenzen der Nanolokalisierung von mobilen Partikeln im Hinblick auf die Zeitauflösung und die Lokalisierungsgenauigkeit
Zusammenfassung der Kapitel
Die Arbeit beginnt mit einer Einleitung, die die Bedeutung der Untersuchung von Transportmechanismen in komplexen biologischen Systemen wie Zellen und deren Kompartimente, insbesondere im Zellkern, erläutert. Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) wird als eine nichtinvasive Technik zur dreidimensionalen Abbildung und Analyse biologischer Proben vorgestellt.
Kapitel 2 beschreibt den Aufbau und die Funktionsweise eines CLSM, wobei die punktförmige Beleuchtung und die konfokale Detektion des Fluoreszenzlichtes erklärt werden. Es werden die unterschiedlichen Aufnahmemodi (x-y, x-z, x-t) und die Punktübertragungsfunktion (PSF) des Mikroskops, die die Abbildung von submikroskopischen Partikeln als punktförmige Lichtquellen beschreibt, erläutert.
Kapitel 3 behandelt die Theorie der Rauschanalyse von Bildern, wobei die verschiedenen Rauschquellen und deren Einfluss auf das Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) diskutiert werden. Es wird ein vereinfachtes Rauschmodell vorgestellt, das die Bestimmung des SRV aus einem digitalen Bild ermöglicht. Anschließend wird die Methode der Nanolokalisierung immobiler submikroskopischer Partikel durch einen Fitprozess einer Gauß-Funktion an die PSF beschrieben. Es werden die Fehlerfunktionen für die einzelnen Parameter des Fits in Abhängigkeit vom SRV und den Aufnahmebedingungen hergeleitet. Abschließend wird die Theorie der Brown'schen Bewegung vorgestellt, die die Grundlage für die Analyse der Trajektorien mobiler Partikel bildet.
Kapitel 4 beschreibt die experimentellen Methoden und Ergebnisse. Es werden die verwendeten Proben (fluoreszierende Mikro-Beads in PAA-Gel und Glycerin) und das CLSM-System charakterisiert. Die Messung der Punktübertragungsfunktion und die Bestimmung der lateralen und axialen Auflösung des Mikroskops werden erläutert. Es folgt die Rauschanalyse der Bilder, wobei die Rauschzahl in Abhängigkeit von der PMT-Spannung und der Mittelungszahl bestimmt wird. Anschließend werden die ein- und dreidimensionalen Lokalisierungsgenauigkeiten von immobilen Partikeln in Abhängigkeit vom SRV gemessen und mit den theoretischen Daten verglichen. Die Messungen an mobilen Partikeln umfassen die Aufnahme von ein- und dreidimensionalen Trajektorien von diffundierenden Beads in Wasser und Glycerin. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten werden mit den theoretischen Werten verglichen.
Kapitel 5 diskutiert die Ergebnisse der Rauschanalyse und der Lokalisierungsgenauigkeit. Es werden die Abweichungen zwischen Theorie und Experiment sowie die Grenzen der Nanolokalisierung von mobilen Partikeln im Hinblick auf die Zeitauflösung und die Lokalisierungsgenauigkeit diskutiert. Der Einfluss des Brechungsindex auf die axiale Lokalisierung wird ebenfalls betrachtet.
Die Arbeit endet mit einer Zusammenfassung und einem Ausblick auf zukünftige Forschungsarbeiten. Es werden mögliche Anwendungen der Nanolokalisierung von Partikeln in biologischen Systemen, wie z.B. die Untersuchung des Transportes durch die Kernpore, diskutiert. Die Verbesserung der Detektionseinheit und die Entwicklung von schnelleren dreidimensionalen Aufnahmetechniken werden als wichtige Herausforderungen für zukünftige Forschungsarbeiten genannt.
Schlüsselwörter
Die Schlüsselwörter und Schwerpunktthemen des Textes umfassen die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), Nanolokalisierung, submikroskopische Partikel, Signal-Rausch-Verhältnis (SRV), Brown'sche Bewegung, Diffusionskoeffizient, Trajektorienanalyse, Zeitauflösung, Ortsauflösung, Zellkern, Transportmechanismen.
- Arbeit zitieren
- Dr. rer. nat. Thorsten Kues (Autor:in), 1997, Zur Genauigkeit der Lokalisierung immobiler und mobiler submikroskopischer Partikel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildanalyse, München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/179107
