[...] Eine der effektivsten Möglichkeiten, die genauen Transportmechanismen zu untersuchen, besteht darin, die Trajektorien einzelner Moleküle und Partikel während des Transportes in lebenden Zellen direkt zu visualisieren und quantitativ auszuwerten [Gosh und Webb, 1994; Schmidt et al, 1995; Schütz et al. 1997; Saxton, 1997]. Dies erfordert Untersuchungsmethoden, die keinen Einfluß auf die Struktur und Funktion einer Zelle haben, aber dennoch in der Lage sind , diese real abzubilden und zu analysieren. Das konfokale-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) stellt eine solche nichtinvasive Technik dar, die es erlaubt dreidimensionale, komplexe biologische Proben in vielfältiger Weise, auch mit realer dreidimensionaler Auflösung, abzubilden und zu analysieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die Möglichkeiten eines konventionellen CLSM im Hinblick auf die Detektion von Trajektorien mobiler submikroskopischer Partikel und Moleküle zu definieren.
Die Größe der betrachteten Moleküle und Partikel liegt deutlich unterhalb der Wellenlänge des Lichtes. Das Bild der submikroskopischen Teilchen ist daher eine Airy-Scheibe mit einem Radius von ca. 200 nm, je nach Apertur des Objektivs. Dadurch ist das Auflösungsvermögen des Mikroskopes begrenzt, d.h. Strukturen, die näher zusammenliegen als der Radius der Airy-Scheibe können nicht mehr getrennt dargestellt werden.
In dieser Arbeit wird nun die Tatsache ausgenutzt, daß die Position des Zentrum einer einzelnen Airy-Scheibe – und damit die Position des abgebildeten Partikels – mit einer Genauigkeit lokalisiert werden kann, die weit unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskopes liegen kann. Die Position des Zentrums wird dabei durch einen Fitprozeß bestimmt. Anhand einer statistischen Analyse dieser Fit-Methode wird ein theoretisches Modell entwickelt, das Voraussagen über die Lokalisierungsgenauigkeit des Zentrums erlaubt. Dabei zeigt sich, daß die theoretische Lokalisierungsgenauigkeit nicht nur von den gewählten Aufnahmeparametern (z.B. Objektiv und Bildfeldgröße), sondern maßgeblich vom erzielbaren Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) der Bilder anhängt.
Daher wird ein Überblick über die vorhandenen Rauschquellen des verwendeten Mikroskopes gegeben und ein Modell entwickelt, das eine genaue Definition des SRV zuläßt. Diese Methode wird durch entsprechende Messungen des Rauschens ergänzt und überprüft. [...]
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Das konfokale Laser-Scannning-Mikroskop (CLSM)
2.1 Der Aufbau des Mikroskopes und das konfokale Prinzip
2.2 Die Bildaufnahme
2.3 Die Punktübertragungsfunktion des CLSM
2.3.1 Die laterale Intensitätsverteilung
2.3.2 Die axiale Intensitätsverteilung
2.3.3 Die Näherung durch eine Gauß-Funktion
3. Theorie
3.1 Rauschanalyse der Bilder
3.1.1 Die Rauschquellen
3.1.1.1 Das Photonenrauschen
3.1.1.2 Das Rauschen der Sekundärelektronen
3.1.1.3 Der Dunkelstrom des Photomultipliers
3.1.1.4 Das Elektronikrauschen
3.1.2 Das Signal-Rausch-Verhältnis
3.1.3 Das vereinfachte Rauschmodell
3.2 Nanolokalisierung immobiler submikroskopischer Partikel
3.2.1 Die Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit
3.2.2 Definition der Fehlergrenzen für die Fitparameter
3.2.3 Die Fehler in den Parametern
3.2.4 Der dreidimensionale Fitprozeß
4. Experimentelle Methoden und Ergebnisse
4.1 Charakterisierung der Proben
4.2 Messung der Punktübertragungsfunktion
4.2.1 Laterale Auflösung
Axiale Auflösung
4.3 Rauschanalyse
4.3.1 Bildaufnahme und -analyse
4.3.2 Bestimmung der Rauschzahl in Abhängigkeit der PMT-Spannung
4.3.3 Messung der Rauschzahl in Abhängigkeit von der Mittelungszahl
4.4 Nanolokalisierung immobiler submikroskopischer Partikel
4.4.1 Eindimensionale Messungen
4.4.2 Dreidimensionale Messungen
4.4.3 Vergleich der Theorie mit den Messungen an immobilen Partikeln
4.5 Nanolokalisierung mobiler submikroskopischer Partikel
4.5.1 Aufnahmegeschwindigkeiten
4.5.2 Eindimensionale Messungen
4.5.3 Dreidimensionale Messungen
4.5.4 Vergleich der gemessenen Diffusionskoeffizienten mit theoretischen Werten
5. Diskussion
5.1 Rauschanalyse der Bilder
5.2 Lokalisierung submikroskopischer Partikel
5.2.1 Abweichung zwischenTheorie und Experiment
5.2.2 Auswirkung des Brechungsindex auf die axiale Lokalisierung
5.2.3 Grenzen für die Nanolokalisierung von mobilen Partikeln
6. Zusammenfassung und Ausblick
Zielsetzung & Themen
Ziel dieser Diplomarbeit ist die Definition der Möglichkeiten eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) zur Detektion der Trajektorien von mobilen submikroskopischen Partikeln und Molekülen. Es wird ein theoretisches Modell zur Lokalisierungsgenauigkeit entwickelt und experimentell verifiziert, um die Grenzen der Nanolokalisierung in Abhängigkeit vom Signal-Rausch-Verhältnis zu bestimmen.
- Grundlagen der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
- Umfassende Rauschanalyse digitaler Mikroskopbilder
- Theoretische Modellierung der Nanolokalisierung immobiler Partikel
- Experimentelle Bestimmung der Lokalisierungsgenauigkeit
- Analyse der Dynamik mobiler Partikel mittels Brown'scher Bewegung
Auszug aus dem Buch
2.1 Der Aufbau des Mikroskopes und das konfokale Prinzip
In einem Mikroskop werden nur diejenigen Präparatstrukturen durch das Objektiv scharf abgebildet, die sich in der Objektebene befinden. Das Bild eines konventionellen Mikroskopes enthält allerdings einen hohen Streulichtanteil aus Ebenen ober- und unterhalb der Objektebene. Es ist daher nicht möglich, eine optimal kontrastreiche Abbildung der Objektebene zu erzielen. Das Prinzip der konfokalen Abbildung besteht darin, dieses Streulicht drastisch zu reduzieren. Dies wird durch eine spezielle Detektionslochblende und die punktförmige Beleuchtung des Präparates ermöglicht.
Abbildung 2.1.1 zeigt den schematischen Aufbau eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopes. Die Lichtquelle ist ein Laser, der über eine Glasfaser in das Mikroskop eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird von einem Strahlteilerspiegel auf die Scannerspiegel reflektiert und vom Objektiv beugungsbegrenzt auf die Probe fokussiert. Das von der Probe emittierte Licht wird vom Objektiv gesammelt und gelangt über die Scannerspiegel wiederum auf den Strahlteiler. Das vom Strahlteiler transmittierte Licht gelangt durch die Detektionslochblende auf einen Photomultiplier. Die Detektionslochblende und die Objektebene liegen dabei in optisch konjugierten Ebenen.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Diese Einleitung erläutert die Bedeutung der Untersuchung der Zellkernarchitektur und des intranukleären Transports sowie die Relevanz nichtinvasiver Mikroskopietechniken für die Biophysik.
2. Das konfokale Laser-Scannning-Mikroskop (CLSM): Dieses Kapitel beschreibt den technischen Aufbau und die Funktionsweise des konfokalen Mikroskops sowie die Grundlagen der Bildaufnahme und der Punktübertragungsfunktion.
3. Theorie: Hier wird ein quantitatives Modell für das Rauschen in digitalen Bildern entwickelt und die theoretische Grundlage für die Lokalisierung submikroskopischer Partikel mittels Fit-Algorithmen dargelegt.
4. Experimentelle Methoden und Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die experimentelle Charakterisierung der Proben und die Durchführung der Messungen zur Bestimmung von Punktübertragungsfunktion, Rauschen und Lokalisierungsgenauigkeit.
5. Diskussion: Die Ergebnisse der Rauschanalyse und der Partikellokalisierung werden kritisch interpretiert und der Fokus auf Einflüsse wie Brechungsindizes und Messgrenzen gelegt.
6. Zusammenfassung und Ausblick: Diese abschließende Zusammenfassung bewertet die Stabilität des CLSM-Systems und diskutiert zukünftige Anwendungsmöglichkeiten der Methode in biologischen Systemen.
Schlüsselwörter
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, CLSM, Nanolokalisierung, Signal-Rausch-Verhältnis, SRV, Punktübertragungsfunktion, PSF, Brown'sche Bewegung, Diffusionskoeffizient, Bildanalyse, Photonenzählung, Lokalisierungsgenauigkeit, submikroskopische Partikel, Trajektorienanalyse.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Optimierung und quantitativen Analyse der Genauigkeit, mit der sich kleine, submikroskopische Teilchen in einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) lokalisieren lassen.
Welche zentralen Themenfelder deckt die Untersuchung ab?
Zu den zentralen Themen gehören die optischen Grundlagen der Mikroskopie, die mathematische Rauschanalyse von digitalen Aufnahmen, die Fehlerrechnung bei der Partikellokalisierung sowie die Anwendung dieser Methoden auf Diffusionsprozesse.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Ziel ist es, ein theoretisches Modell zu entwickeln und experimentell zu validieren, das Voraussagen über die erreichbare Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit von den Aufnahmebedingungen erlaubt.
Welche wissenschaftliche Methode wird zur Partikellokalisierung verwendet?
Die Arbeit nutzt die Anpassung (Fit) einer dreidimensionalen Gauß-Funktion an das beugungsbegrenzte Signal der Partikel, um deren Zentrum mit einer Genauigkeit weit unterhalb der klassischen Auflösungsgrenze zu bestimmen.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine theoretische Herleitung der Rauschquellen und Fit-Modelle sowie in einen experimentellen Teil, in dem an Mikro-Beads in verschiedenen Medien die Lokalisierungsgenauigkeit und Diffusionskoeffizienten bestimmt werden.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit ist geprägt durch Begriffe wie CLSM, Signal-Rausch-Verhältnis (SRV), Punktübertragungsfunktion (PSF), Brown'sche Bewegung und Nanolokalisierung.
Welchen Einfluss hat die PMT-Spannung auf die Bildqualität?
Die Arbeit zeigt, dass eine Erhöhung der Spannung am Photomultiplier (PMT) zwar das Signal verstärkt, aber auch das Rauschen in gleichem Maße mitverstärkt, sodass das Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) unverändert bleibt.
Warum spielt der Brechungsindex für die Messungen eine Rolle?
Unterschiedliche Brechungsindizes zwischen Deckglas und Probenmedium führen zu Aberrationen der Punktübertragungsfunktion, die besonders bei axialen Messungen einen Skalierungsfaktor zur Korrektur erfordern.
Was begrenzt die Nanolokalisierung mobiler Partikel?
Die Lokalisierung mobiler Partikel ist durch die endliche Aufnahmegeschwindigkeit und die notwendige statistische Sicherheit begrenzt; bei zu hohen Geschwindigkeiten treten Bewegungsunschärfen auf, die den Fit unmöglich machen.
- Arbeit zitieren
- Dr. rer. nat. Thorsten Kues (Autor:in), 1997, Zur Genauigkeit der Lokalisierung immobiler und mobiler submikroskopischer Partikel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildanalyse, München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/179107
