Zytostatika werden seit über 50 Jahren erfolgreich zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt. Im Detail ist allerdings unklar, welche zellulären Prozesse beim Einsatz von Zytostatika betroffen sind. Diese Arbeit zeigt, dass man die rRNA-Synthese, und damit die Hauptfunktion des Nukleolus, mit einer Reihe zytostatisch wirksamer Substanzen hemmen kann. Es gibt prinzipiell zwei Arten der Hemmung, die Transkriptions- oder die Prozessierungshemmung. Als besonders wirksame Zytostatikaklassen lassen sich die Interkalantien (Transkriptionshemmer) sowie die Kinaseinhibitoren und die Translationsinhibitoren (Prozessierungshemmer) definieren. Sie hemmen die rRNA-Synthese spezifisch, vollständig und zum Teil nicht-genotoxisch. Eine blockierte rRNA-Synthese führt zu mehreren definierbaren zellulären Stressantworten. Die Mehrheit der wirksamen Substanzen erzeugt eine Disintegration des Nukleolus, die einhergeht mit der Translokation nukleolärer Proteine (Nukleophosmin, Pescadillo1, Fibrillarin) aus dem Nukleolus sowie der Induktion von p53. Ausgewählte Substanzen sind auch in Kombinationen auf rRNA-Synthesehemmung und p53-Induktion getestet worden. Dabei konnten sowohl additive wie synergistische Phänomene bei der Hemmung der rRNA-Synthese nachgewiesen werden. Die Kombination aus 5-FU und Flavopiridol ist von besonderem Interesse, da sie neue Perspektiven zur Erforschung der molekularen rRNA-Synthesemechanismen aufzeigt und gleichzeitig Anreize zur Verbesserung klinischer Therapieschemata bietet. Die Kinaseinhibitoren an sich stellen eine interessante Zytostatikaklasse dar. Mit ihnen lassen sich eine überschaubare Anzahl nukleolärer Kinasen hemmen, was zu einer starken Hemmung der rRNA-Prozessierung führt. Spezifische nukleolärer Kinasen könnten deshalb als Zielproteine zur Entwicklung neuer Chemotherapeutika interessant sein. Auf diesem Feld sind weitere Experimente nötig, um einen klareren Einblick in die molekulare Wirkung und Regulation der Kinasen in der Ribosomenbiogenese zu bekommen.
Die Bedeutung dieser Arbeit liegt darin, mit dem Nukleolus ein Subkompartiment zu untersuchen, das mit der Ribosomenbiogenese als Hauptfunktion an vielen Prozessen der Wachstums-, Proliferations- und Zellzyklusregulation beteiligt ist. Die Ribosomenbiogenese wir mit einer großen Zahl unterschiedlichster zytostatisch wirksamer Substanzen auf mögliche therapeutische Angriffspunkte überprüft.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Anfänge der Nukleolusforschung
1.2 Nukleoläre Struktur und Proteom
1.3 Nukleoläre Funktionen: Hauptfunktion Ribosomenbiogenese
1.4 Weitere nukleoläre Funktionen: Biogenese nicht-ribosomaler Ribonukleoproteine
1.5 Ribosomenbiogenese im Kontext von Zellzyklus und Proliferation
1.6 Der Nukleolus als Stresssensor
2. Aufgabenstellung
3. Material
3.1 Zytostatika
3.2 Chemikalien
3.3 Puffer und Lösungen
3.4 Kulturmedien
3.5 Antikörper
3.6 Zelllinien
3.7 Verbrauchsmaterialien
3.8 Geräte
3.9 Software
4. Methoden
4.1 Zellkultur
4.1.1 Auftauen von Zellen
4.1.2 Kultivieren von Zellen
4.1.3 Plattieren von Zellen
4.1.4 Einfrieren von Zellen
4.2 Metabolisches Markierungsexperiment
4.2.1 In vivo Markierung
4.2.2 Isolierung der Gesamtzell-RNA
4.2.3 Agarosegelelektrophorese
4.2.4 Trocknen
4.2.5 Autoradiographie und Quantifizierung
4.3 Immunfluoreszenzmikroskopie
4.4 Western-Analyse
5. Ergebnisse
5.1 Einfluss der Zytostatika auf die rRNA-Synthese
5.1.1 Einfluss der Alkylantien auf die rRNA-Synthese
5.1.2 Busulfan
5.1.3 Nimustin
5.1.4 Cisplatin
5.1.5 Einfluss der Interkalantien auf die rRNA-Synthese
5.1.6 Mitoxantron
5.1.7 Mitomycin C
5.1.8 Einfluss der Antimetaboliten auf die rRNA-Synthese
5.1.9 Methotrexat
5.1.10 Hydroxyharnstoff
5.1.11 Einfluss der Mitose- und Topoisomerasehemmer auf die rRNA-Synthese
5.1.12 Campthotecin
5.1.13 Paclitaxel
5.1.14 Einfluss der Kinaseinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.15 Flavopiridol
5.1.16 Roscovitin
5.1.17 Einfluss der Proteasominhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.18 Bortezomib
5.1.19 Einfluss der Histondeacetylaseinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.20 Einfluss der Translationsinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.21 Homoharringtonin
5.1.22 Zusammenfassung der Zytostatikatitrationen
5.2 Einfluss der Zytostatika auf die nukleoläre Struktur
5.2.1 Nukleoläre Lokalisation nach zytostatischem Stress mit Transkriptionsinhibitoren
5.2.2 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Mitoxantron
5.2.3 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Methotrexat
5.2.4 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Cisplatin
5.2.5 Nukleoläre Lokalisation nach zytostatischem Stress mit Prozessierungsinhibitoren
5.2.6 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Campthotecin
5.2.7 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Behandlung mit Flavopiridol
5.2.8 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Homoharringtonin
5.2.9 NPM-Lokalisation nach Stress mit schwach/langsam oder nicht wirksamen Substanzen
5.3 Einfluss der Zytostatika auf die p53-Menge
5.3.1 p53-induzierende Zytostatika
5.3.2 Mitoxantron
5.3.3 Methotrexat
5.3.4 Cisplatin
5.3.5 Campthotecin
5.3.6 Flavopiridol
5.3.7 p53-hemmende Zytostatika
5.3.8 Homoharringtonin
5.3.9 Rapamycin
5.3.10 Paclitaxel
5.3.11 Zusammenfassung der IF- und WB-Analysen
5.4 Kombinationsexperimente
5.4.1 Epistasieexperiment in der p53-Antwort
5.4.2 Additive und synergistische Wirkungen der Zytostatika
6. Diskussion
6.1 Einfluss der Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese
6.2 Nukleolärer Stress - strukturelle Folgen der Zytostatikabehandlungen
6.3 Nukleolärer Stress - funktionale Folgen der Zytostatikabehandlungen
6.4 Nukleolus und Ribosomenbiogenese als Ziel in der Chemotherapie
7. Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit besteht in der systematischen Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese in humanen Zellen. Dabei wird analysiert, ob und in welcher Weise diese Substanzen die rRNA-Transkription und -Prozessierung hemmen, wie sie die nukleoläre Struktur und die NPM-Lokalisation beeinflussen sowie welchen Effekt sie auf die p53-Konzentration ausüben, um potenzielle antiproliferative Wirkmechanismen aufzuklären.
- Analyse der rRNA-Synthese mittels metabolischer Markierungsexperimente.
- Untersuchung von strukturellen Veränderungen des Nukleolus durch Immunfluoreszenz-Analysen.
- Erfassung der p53-Antwort durch Western-Blot-Analysen zur Bestimmung zellulärer Stressreaktionen.
- Evaluation kombinierter Chemotherapien hinsichtlich additiver oder synergistischer Wirkungen.
- Einordnung der Befunde in den Kontext von Zellzyklusregulation und Tumorbiologie.
Auszug aus dem Buch
1.1 Anfänge der Nukleolusforschung
Im Jahr 1781 konnte Felice Fontana anhand lichtmikroskopischer Analysen eine eiförmige Struktur im Zellkern beschreiben und hat damit den Nukleolus entdeckt. Mehr als 150 Jahre danach begann man zu Verstehen, welche Bedeutung der Nukleolus hat. Barbara McClintock hatte den Nukleolus 1934 mit Genaktivität in Verbindung gebracht (McClintock 1934). Nachdem man RNA im Nukleolus nachweisen konnte, wurden ribosomale Gene und Nucleolar Organising Regions als deren Loci definiert (Perry 1962, Ritossa und Spiegelmann 1965). Zur selben Zeit haben biochemische Charakterisierungen isolierter Nukleoli dazu geführt, dass man den Nukleolus als Ort der Ribosomenbiogenese definiert hat (Miller und Beatty 1969).
Heute weiß man, dass sich die Nukleoli als Subkompartimente im Nukleus an tandem-repetitiven Clustern aktiver ribosomaler Gene (rDNA) bilden. Die Cluster werden als Nucleolar Organising Regions bezeichnet und befinden sich beim Menschen an den Enden aller akozentrischen Chromosomen. In den Nucleolar Organising Regions kommt es zu einer lokalen Konzentration von Faktoren der Transkriptions- und Prozessierungsmaschinerie, was die lichtmikroskopische Darstellung des Nukleolus erlaubt.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel gibt einen historischen Überblick über die Nukleolusforschung, beschreibt die nukleoläre Struktur, Proteomik und die grundlegenden Prozesse der Ribosomenbiogenese unter Berücksichtigung von Zellzyklus und Stressantwort.
2. Aufgabenstellung: Hier wird das Ziel formuliert, die Wirkung verschiedener Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese, die nukleoläre Struktur, die NPM-Lokalisation und die p53-Menge systematisch zu untersuchen.
3. Material: Dieser Abschnitt listet detailliert die verwendeten Zytostatika, Chemikalien, Puffer, Zelllinien und Laborausrüstung auf.
4. Methoden: Hier werden die experimentellen Protokolle wie Zellkulturtechniken, das metabolische Markierungsexperiment, die Immunfluoreszenzmikroskopie und die Western-Analyse zur Durchführung der Untersuchungen beschrieben.
5. Ergebnisse: Der Hauptteil präsentiert die gewonnenen Daten zur Wirkung der verschiedenen Zytostatikaklassen auf die rRNA-Synthese, die nukleoläre Proteinlokalisation, die p53-Induktion sowie die Effekte von Kombinationstherapien.
6. Diskussion: Dieses Kapitel interpretiert die Ergebnisse im Kontext aktueller wissenschaftlicher Erkenntnisse, diskutiert die Wirkweisen der verschiedenen Substanzklassen und beleuchtet die Rolle des Nukleolus als Zielstruktur in der Chemotherapie.
7. Zusammenfassung: Die Arbeit schließt mit einer knappen Zusammenfassung der wichtigsten Erkenntnisse über die spezifische Hemmung der rRNA-Synthese und deren zelluläre Auswirkungen ab.
Schlüsselwörter
Nukleolus, Ribosomenbiogenese, Zytostatika, rRNA-Synthese, p53, Zellzyklus, NPM, Fibrillarin, Pescadillo1, DNA-Interkalation, Prozessierung, Transkriptionshemmung, Stressantwort, Chemotherapie, Apoptose.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht, wie chemotherapeutische Medikamente die Struktur und Funktion des Nukleolus sowie die Synthese von ribosomalen RNAs beeinflussen, um deren antiproliferative Wirkung zu verstehen.
Was sind die zentralen Themenfelder der Studie?
Die Arbeit deckt die Ribosomenbiogenese, die zelluläre Stressantwort, die Wirkung von Zytostatika auf die rRNA-Synthese sowie die damit verbundene Regulation des Tumorsuppressor-Proteins p53 ab.
Welches primäre Ziel verfolgt die Forschungsfrage?
Das Hauptziel ist es, die Wirkung verschiedener Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese zu untersuchen und dabei zu klären, ob diese gezielt rRNA-Transkription oder -Prozessierung hemmen.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Zur Anwendung kommen metabolische Markierungsexperimente (Pulse-Chase), Immunfluoreszenzmikroskopie zur Lokalisation von Proteinen und Western-Analyse zur Quantifizierung der p53-Menge.
Was wird im umfangreichen Ergebnisteil behandelt?
Es werden zahlreiche Zytostatikaklassen (z.B. Alkylantien, Interkalantien, Kinaseinhibitoren) systematisch auf ihren Einfluss auf die rRNA-Syntheserate und die strukturelle Integrität des Nukleolus titriert und bewertet.
Welche Schlüsselbegriffe definieren die Arbeit?
Die Arbeit konzentriert sich auf Begriffe wie Ribosomenbiogenese, nukleolärer Stress, Zytostatika, rRNA-Synthese, p53-Regulation und die nukleoläre Lokalisation von Proteinen wie NPM und Fibrillarin.
Wie wirkt sich zytostatisch induzierter Stress auf den Nukleolus aus?
Zytostatikabedingter Stress führt häufig zu einer Disintegration des Nukleolus und zur Translokation nukleolärer Proteine wie NPM in das Nukleoplasma, was oft mit einer p53-Induktion korreliert.
Gibt es synergistische Effekte bei Kombinationstherapien?
Die Arbeit zeigt, dass die Kombination von 5-FU und Flavopiridol bei der rRNA-Prozessierungshemmung synergistische Effekte auf das Verhältnis von intermediären zu reifen rRNA-Formen ausübt.
Was bedeutet das "Riding the ribosome"-Modell in diesem Kontext?
Es beschreibt ein Modell, bei dem p53 im Komplex mit ribosomalen Faktoren reguliert abgebaut wird; der Nukleolus spielt dabei eine zentrale Rolle, da er als "Stresssensor" die p53-Stabilisierung beeinflussen kann.
- Arbeit zitieren
- Kaspar Burger (Autor:in), 2008, Auswirkungen von chemotherapeutischem Stress auf die Struktur und die Funktion des Nukleolus, München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/174250
