Das HMGA2-Protein gehört zur Familie der HMG-Proteine (High Mobility Group-Proteine), welche ihren Namen aufgrund der hohen Laufgeschwindigkeit in der Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten hat (Tallini u. Dal Cin, 1999). HMG-Proteine wurden 1973 von Goodwin et al. erstmals entdeckt und beschrieben. Sie sind Chromatin assoziierte Nicht-Histon-Proteine, die als architektonische Transkriptionsfaktoren an AT reiche Regionen der DNA binden können (Bustin u. Reeves, 1996). HMG-Proteine können den Aufbau von Kernprotein-Strukturen, welche an der Transkription, der Replikation sowie der Chromatin-Konformation beteiligt sind, beeinflussen. Dies geschieht mit Hilfe eines komplexen Netzwerks von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen (Ferguson et al., 2003). Aufgrund ihrer Funktion als Transkriptionsregulatoren spielen HMG Proteine eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen, die auf Mutationen beruhen, welche die chromosomalen Regionen der entsprechenden Proteine betreffen. HMG-Proteine zeichnen sich durch einige gemeinsame chemische und physikalische Eigenschaften aus. Sie können vom Chromatin mit 0,35 M NaCl extrahiert werden, besitzen eine molekulare Masse kleiner als 30 kDa, sind löslich in 5% Perchlorsäure sowie Trichlorsäure und weisen einen hohen Anteil an geladenen Aminosäuren auf (Johns, 1982; Cleynen u. Van de Ven, 2007). Die Familie der HMG-Proteine besteht aus den drei Subfamilien A, B und N, die sich aufgrund charakteristischer, funktioneller Sequenzmotive voneinander unterscheiden (Catez et al., 2004; Flohr et al., 2003; Prymakowska-Bosak et al., 2001). Die Interaktion zwischen HMG-Proteinen und DNA bzw. Chromatin erfolgt mit Hilfe dieser Sequenzmotive. Bezeichnend für die jeweilige Bindungsdomäne ist der letzte Buchstabe der Subfamilien. Die Bindungsdomäne der HMGA-Proteine ist der so genannte AT-Hook, die HMG-Box ist die Bindungsdomäne der HMGB-Proteine und die nukleosomale Bindungsdomäne ist charakteristisch für HMGN-Proteine (Bustin, 1999).
Die HMGN-Subfamilie umfasst die Proteine HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b und HMGN4, wobei HMGN3a und HMGN3b alternative Splicevarianten sind. Diese Proteine werden ubiquitär exprimiert. Indem sie an die Innenseite nukleosomaler DNA binden, beeinflussen die HMGN-Proteine die Interaktion zwischen DNA und dem Histonoktamer (Bustin u. Reeves, 1996; Shick et al., 1985). HMGN-Proteine besitzen eine so genannte Chromatin-Aktivierungsdomäne, die ihnen die Fähigkeit verleiht, das Chromatin...
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Materialien
2.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
2.2 Chemikalien
2.3 Lösungen und Puffer
2.4 Medien
2.5 Hefestämme
2.6 Bakterienstämme
2.7 DNA-Molekulargewichtsmarker
2.8 Primer
2.9 Vektoren
2.10 Kits
2.11 Enzyme
2.12 Software
3 Methoden
3.1 Kultivierung von Prokaryoten
3.1.1 Kultivierung von Prokaryoten auf Agarplatten
3.1.2 Flüssigkulturen von Prokaryoten
3.1.3 Anlegen von Glycerolstocks
3.2 Kultivierung von Eukaryoten
3.2.1 Kultivierung von Eukaryoten auf Agarplatten
3.2.2 Flüssigkulturen von Eukaryoten
3.3 Isolierung von Plasmid DNA aus Prokaryoten
3.3.1 Plasmid Midiprep mittels QIAGEN® Plasmid Midi Kit
3.3.2 Plasmid Maxiprep mittels QIAGEN® Plasmid Maxi Kit
3.3.3 Schnelle DNA-Isolierung
3.4 Isolierung von Plasmid DNA aus Eukaryoten
3.4.1 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAprep® Spin Miniprep Kit
3.4.2 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAGEN® Plasmid Mini Kit und Lyticase
3.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
3.5.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung mittels Photometrie
3.5.2 Konzentrationsbestimmung mittels Agarose-Gelelektrophorese
3.6 Restriktionsverdau
3.6.1 Restriktionsverdau zum Qualitätstest von Plasmiden
3.6.2 Restriktionsverdau zur Klonierung von DNA-Fragmenten
3.7 Dephosphorylierung
3.8 Ligation
3.9 Agarose-Gelelektrophorese
3.10 Aufreinigung von DNA aus einem Agarosegel
3.10.1 Aufreinigung von DNA mittels QIAquick™ Gel Extraction Kit
3.10.2 Aufreinigung von DNA mittels QIAEX® II Gel Extraction Kit
3.11 PCR-Purification mittels QIAquick™ PCR Purification Kit
3.12 Transformation in Prokaryoten
3.12.1 Herstellung thermokompetenter Bakterien E. coli DH5α
3.12.2 Thermotransformation in Prokaryoten
3.12.3 Ermittlung der Transformationseffizienz
3.13 Transformation in Eukaryoten
3.13.1 Herstellung kompetenter Hefezellen S. cerevisiae AH109
3.13.2 PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten (Gietz et al., 1992)
3.13.3 Ermittlung der Transformationseffizienz
3.14 Polymerase Kettenreaktion
3.14.1 Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur mittels Gradienten-PCR
3.14.2 PCR zur Überprüfung der PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten
3.15 Sequenzierung
4 Ergebnisse
4.1 Isolierung von Plasmid DNA und Überprüfung der Vektoren
4.1.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung isolierter Plasmid DNA
4.1.2 Restriktionsverdau zur Überprüfung der Vektoren pGBKT7 und pET-3a-HMGA2
4.2 Klonierung von HMGA2 in pGBKT7
4.2.1 Restriktionsverdau der Vektoren pET-3a-HMGA2 und pGBKT7
4.2.2 Ligation des Vektors pGBKT7 mit dem HMGA2-Insert
4.3 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in E. coli
4.3.1 Zählung der gewachsenen Klone und Ermittlung der Transformationseffizienz
4.3.2 Restriktionsanalysen des Vektors pGBKT7-HMGA2 nach Schnellprep
4.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung nach Midiprep
4.3.4 Restriktionsverdau nach Midiprep
4.4 Sequenzierung
4.5 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae
4.5.1 Ermittlung der Transformationseffizienz
4.6 PCR-Analysen
4.6.1 Gradienten-PCR zur Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur verschiedener Primer
4.6.2 PCR zur Überprüfung der Transformation von pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae
5 Diskussion
6 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieser Diplomarbeit war die Identifizierung von HMGA2-interagierenden Proteinen mittels Yeast-2-Hybrid-Systemen. Hierbei sollte ein Bait-Vektor (pGBKT7-HMGA2) konstruiert und in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden, um Interaktionen innerhalb einer cDNA-Library zu untersuchen.
- Methoden der Proteinteraktion und Proteomik
- Klonierungsstrategien von HMGA2 in den Bait-Vektor pGBKT7
- Transformation von Prokaryoten und Eukaryoten
- Analyse von DNA-Konzentrationen und Reinheit
- Validierung durch PCR und Restriktionsanalyse
Auszug aus dem Buch
Ziel dieser Diplomarbeit
Ziel dieser Diplomarbeit war es, mit HMGA2 interagierende Proteine zu detektieren. Zu diesem Zweck sollten Yeast-2-Hybrid-Versuche durchgeführt werden. Yeast-2-Hybrid-Screens, erstmals 1989 von Fields und Song beschrieben, sind eine äußerst sensitive Methode, um Interaktionen zwischen Proteinen in vivo zu untersuchen. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der Fusion eines Proteins X, dem so genannten „bait“-Protein, mit der Gal4-DNA-Bindungsdomäne (Abb. 3, orange) und der Fusion eines Proteins Y, dem so genannten „prey“-Protein, mit der Gal4-Aktivatordomäne (Abb. 3, violett; Phizicky et al., 2003). Beiden Domänen ist es alleine nicht möglich, die Expression von Reportergenen auszulösen. Interagieren jedoch die beiden Fusionspartner X und Y, kommen die DNA-Bindungsdomäne und die Aktivatordomäne in räumliche Nähe, so dass die Transkription der Reportergene aktiviert werden kann (Abb. 3, Pfeil; Phizicky u. Fields, 1995).
Der in dieser Arbeit verwendete Assay (Matchmaker™ Pretransformed Normalized Human Universal cDNA Library, Clontech Lab. Inc.) besitzt eine hohe Sensitivität durch die Verwendung von vier verschiedenen Reportergenen (ADE2, lacZ, HIS3, MEL1) (Matchmaker™ User Manual, 2007).
Ein weiterer Vorteil dieser Methode gegenüber anderen Interaktionstests in vitro ist das zelleigene Milieu, in dem die Interaktionen untersucht werden. Demzufolge ist keine biochemische Aufreinigung nötig (Phizicky u. Fields, 1995). Als Host wird die Bäckerhefe S. cerevisiae verwendet.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Theoretische Einführung in die Familie der HMG-Proteine, deren Funktion sowie die methodischen Grundlagen des Yeast-2-Hybrid-Systems.
2 Materialien: Auflistung der verwendeten Geräte, Chemikalien, Medien, Hefestämme, Bakterienstämme, Primer und Vektoren.
3 Methoden: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Protokolle zur Kultivierung, DNA-Isolierung, Klonierung, Transformation und PCR-Analytik.
4 Ergebnisse: Darstellung der Klonierungsergebnisse, Konzentrationsmessungen und Analysen mittels Agarose-Gelelektrophorese.
5 Diskussion: Interpretation der erzielten Ergebnisse, Reflexion über aufgetretene Klonierungsprobleme und Ausblick auf zukünftige Forschungsansätze.
6 Zusammenfassung: Kompakte Übersicht über die wissenschaftliche Arbeit und deren zentrale Erkenntnisse bezüglich des Bait-Vektors pGBKT7-HMGA2.
Schlüsselwörter
HMGA2, HMG-Proteine, Yeast-2-Hybrid, Proteinteraktion, Bait-Vektor, Plasmid DNA, S. cerevisiae, Klonierung, PCR, Restriktionsverdau, Transformation, cDNA-Library, Proteinanalyse, Genexpression, Proteomik.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in der Arbeit grundlegend?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen des HMGA2-Proteins mithilfe des Yeast-2-Hybrid-Verfahrens.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Zentrale Themen sind die Molekularbiologie der HMG-Proteine, Klonierungstechniken sowie die funktionelle Analyse von Proteinkomplexen in vivo.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Ziel ist es, bisher unbekannte Interaktionspartner für HMGA2 zu finden, um neue Erkenntnisse über dessen Rolle bei zellulären Prozessen zu gewinnen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Die Arbeit nutzt hauptsächlich das Yeast-2-Hybrid-Screening-Verfahren, ergänzt durch klassische molekularbiologische Methoden wie PCR, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der detaillierten Konstruktion des Bait-Vektors pGBKT7-HMGA2, der anschließenden Transformation in E. coli und Hefezellen sowie der analytischen Überprüfung der Klonierungserfolge.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind HMGA2, Yeast-2-Hybrid, Bait-Vektor, Proteinteraktion, Transformation und cDNA-Library.
Warum traten bei der Transformation in E. coli Schwierigkeiten auf?
Es wird vermutet, dass das HMGA2-Protein eine toxische Wirkung auf die verwendeten Bakterienzellen ausübte, was zu einem Selektionsvorteil für Klone ohne Insert führte.
Welche Schlussfolgerungen werden aus den Sequenzanalysen gezogen?
Die Sequenzierungen zeigten, dass das gewünschte HMGA2-Insert in den untersuchten Klonen nicht korrekt enthalten war, was weitere methodische Anpassungen für die Klonierungsstrategie erforderlich macht.
- Arbeit zitieren
- Dipl.-Biol. Wiebke Gelder (Autor:in), 2009, Identifizierung von mit HMGA2 interagierenden Proteinen, München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/171233
