Zellpenetrierende Peptide (CPPs) stellen ein innovatives Konzept zur Transfektion von Oligonukleotiden in Säugerzellen dar. Die amphipatischen Peptide der sogenannten MPG-Familie bestehen aus einer hydrophoben und einer positiv geladenen Domäne und komplexieren Oligonukleotide spontan über nicht-kovalente Bindungen. Durch den Austausch der hydrophoben
Domäne gegen andere hydrophobe, virale Fusionssequenzen, wurden im Vorfeld dieser Arbeit weitere CPPs entwickelt, die ebenfalls Komplexe mit Oligonukleotiden ueber nicht-kovalente
Bindungen bilden. Um die biologische Anwendung der CPPs verbessern zu können, ist zunächst ein fundiertes biophysikalisches Verständnis der Komplexeigenschaften notwendig.
Deshalb lag der Fokus dieser Arbeit in der transientenkinetischen Analyse der Peptid/Oligonukleotid-Komplexbildung. Mittels Stopped-Flow Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Komplexbildung
in mindestens drei Schritten abläuft, dass elektrostatische sowie hydrophobe Wechselwirkungen daran beteiligt sind, und dass die Dissoziationskonstanten von Initialkomplexen
im nanomolaren Bereich liegen. Durch zeitabhängige DLS Messungen konnte die Hypothese bestätigt werden, dass die hydrophobe Peptiddomaene für die Ausbildung von hochmolekularen
Sekundär- und Tertiaerkomplexen verantwortlich ist. Weiterhin lieferten die im DLS ermittelten Komplexradien zusätzlich Hinweise auf die postulierte endosomale Komplexaufnahme.
Da die Komplexstabilität einen wichtigen Parameter der Transfektionseffzienz darstellt, wurde diese über Heparin induzierte Komplexdissoziationsexperimente sowie electrophoretic mobility shift assay (EMSA) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die hydrophobe Domäne essentiell für
die Ausbildung stabiler Komplexe ist und dass die Transfektionseffzienz mit der Komplexstabilität korreliert.
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1 Oligomere Nukleinsäure-Wirkstoffe
2.1.1 Aptamere
2.1.2 Steric block Oligonukleotide
2.1.3 short interfering RNA
2.2 Nukleinsäuretransport in die Zelle
2.3 Zellpenetrierende Peptide
2.4 Vorarbeiten
2.5 Zielsetzung
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Chemikalien
3.1.2 Puffer
3.1.3 Verbrauchsmaterialien
3.1.4 Geräte
3.1.5 Verwendete Peptid-Carrier
3.1.6 Verwendete Oligonukleotid-Cargos
3.1.7 Verwendete Fluorophore
3.2 Methoden
3.2.1 Peptid- und Nukleinsäure-Konzentrationsbestimmung
3.2.2 Lagerung und Behandlung der CPPs
3.2.3 Stopped-Flow Messungen
3.2.3.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
3.2.3.2 Bestimmung der Komplexstöchiometrien
3.2.3.3 Heparin induzierte Komplexdissoziation
3.2.4 Dynamische Lichtstreuung (DLS)
3.2.5 Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren
3.2.6 EMSA
3.2.7 Autoradiographie
3.2.8 Computer-unterstützte Hydrophobizitätsbestimmungen von Peptiden
4 Ergebnisse
4.1 MPGα
4.1.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.1.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.1.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.2 MPGβ
4.2.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.2.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.2.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.3 fpEbola-NLS
4.3.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.3.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.3.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.4 fpIVHA-NLS
4.4.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.4.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.4.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.5 fpRSV-NLS
4.5.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.5.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.5.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.6 fpFertilinα-NLS
4.6.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.6.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.6.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.7 MPGα + 6K
4.7.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.7.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.7.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.8 fpBLV-NLS
4.8.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.8.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.8.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.9 fpSV-NLS
4.9.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.9.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.10 fpMVi-NLS und fpMVn-NLS
4.10.1 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.10.2 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.11 (Arginin)7
4.11.1 Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
4.11.2 Komplexgrößenanalyse mittels DLS
4.11.3 Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
4.12 Linker-NLS
4.13 Ubersicht der kinetischen Parameter der Komplexbildung
4.14 Zusammenfassung der DLS-Messungen
4.15 Zusammenfassung der EMSA-Versuche
4.16 Korrelation zwischen Komplexgröße und Geschwindigkeit der Komplexassoziation
4.17 Heparin induzierte Komplexdissoziation
4.18 Hydrophobizitätsbestimmung von CPPs
5 Diskussion
5.1 Mechanismus der Komplexbildung
5.2 Geschwindigkeit der Komplexbildung in Abhängigkeit von der Peptidkonzentration
5.3 Einfluss der hydrophoben Domäne auf die Komplexgröße und Komplexstabilität
5.4 Einfluß der hydrophoben Domäne auf die Transfektionseffizienz
6 Anhang
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit verfolgt das Ziel, die Komplexbildung zwischen verschiedenen zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) und Oligonukleotiden biophysikalisch zu charakterisieren. Im Zentrum steht dabei die systematische Untersuchung des Komplexbildungsmechanismus, der Größe der Komplexe sowie deren Stabilität im zeitlichen Verlauf, um den Einfluss der hydrophoben Peptid-Domäne auf die Stabilität und Effizienz der Transfektion zu bestimmen.
- Transient-kinetische Analyse der Peptid-Oligonukleotid-Komplexbildung
- Untersuchung von Komplexgrößen mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS)
- Analyse der Komplexstabilität durch Heparin-induzierte Dissoziation und EMSA
- Vergleichende Charakterisierung verschiedener viraler Fusionspeptide
- Einfluss der Peptid-Hydrophobizität auf die Bildung stabiler Sekundär- und Tertiärkomplexe
Auszug aus dem Buch
Mechanismus der Komplexbildung
Die transientenkinetischen Stopped-Flow Experimente haben gezeigt, dass die Komplexbildung zwischen amphipatischen CPPs und Oligonukleotiden in mindestens drei Schritten abläuft. Die Tatsache, dass der erste dieser Schritte in weniger als einer Sekunde abläuft (siehe Tabelle 5), unterstützt die Hypothese, dass dieser initiale Schritt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den positiv geladenen AS der NLS (vier Lysine; ein Arginin) und den negativ geladenen Phosphationen im Nukleinsäurerückgrat vollzogen wird. Diese beobachtete schnelle 1. Phase korreliert mit dem hypothetischen Modell der Komplexbildung (Abbildung 3), nach dem die Initialkomplexbildung ebenfalls durch die elektrostatische Interaktion mehrerer Peptide mit einer Nukleinsäure zustande kommt.
Bei der 1. Phase konnte außerdem ein starkes Quenching der Fluorophore beobachtet werden; das bedeutet, dass durch die initiale Bindung der Peptide an die Oligonukleotide das an das Oligonukleotid gebundene Fluorophor räumlich stark abgeschirmt wird. Daraus kann gefolgert, dass auch das Oligonukleotid räumlich unzugänglicher wird und somit einen physikalischen Schutz (z. B. vor dem Abbau durch Nukleasen) erfährt.
Da die Komplexbildung ein dynamischer Prozess ist, gestaltet sich die Interpretation der beobachteten 2. Phase etwas schwieriger. Zum einen besteht die Möglichkeit, dass sich in dieser Phase weitere Peptide an das Oligonukleotid anlagern. Andererseits könnten sich auch mehrere Initialkomplexe über hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Domänen der Peptide zu größeren Sekundärkomplexen zusammenlagern. Die langsame 3. Phase wird sehr wahrscheinlich durch die Zusammenlagerung bereits vorhandener Peptid/Oligonukleotid-Komplexe über hydrophobe Wechselwirkungen bestimmt, was zum einen durch das Fehlen einer 3. Phase bei der Komplexbildung mit dem (Arginin)7 unterstützt wird und zum anderen die in Kapitlel 4.16 beschriebenen drastischen Größenzunahmen zeigen.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Zusammenfassung: Diese Arbeit charakterisiert die Komplexbildung zwischen CPPs und Oligonukleotiden mittels transientenkinetischer Analysen und DLS, wobei die entscheidende Rolle der hydrophoben Peptid-Domäne für die Stabilität identifiziert wird.
2 Einleitung: Es werden die Grundlagen der Nukleinsäure-Wirkstoffe, der endozytotischen Aufnahmewege und die Bedeutung zellpenetrierender Peptide für den therapeutischen Transport diskutiert.
3 Material und Methoden: Detaillierte Auflistung der verwendeten Chemikalien, Geräte und biophysikalischen Methoden wie Stopped-Flow, DLS und EMSA zur Analyse der Peptid-Oligonukleotid-Komplexe.
4 Ergebnisse: Systematische Darstellung der kinetischen Parameter, Komplexgrößen und Stabilitätsanalysen für die untersuchten verschiedenen Peptid-Carrier.
5 Diskussion: Interpretation der Ergebnisse im Hinblick auf den dreistufigen Komplexbildungsmechanismus, die Bedeutung der hydrophoben Domäne für die Stabilität und die daraus resultierende Transfektionseffizienz.
6 Anhang: Enthält das Abkürzungsverzeichnis und ergänzende Informationen zur Nomenklatur der Aminosäuren.
Schlüsselwörter
Zellpenetrierende Peptide, CPP, Oligonukleotide, Komplexbildung, Stopped-Flow, Dynamische Lichtstreuung, DLS, EMSA, Nukleinsäuretransport, Hydrophobizität, Transfektionseffizienz, Komplexstabilität, MPG-Familie, Initialkomplex, Sekundärkomplexe.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die biophysikalischen Eigenschaften von Komplexen, die aus zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) und verschiedenen Oligonukleotid-Wirkstoffen gebildet werden, um deren Eignung als Transfektionssysteme besser zu verstehen.
Was sind die zentralen Themenfelder der Studie?
Die zentralen Themen sind die Kinetik der Komplexbildung, die Bestimmung der Komplexgröße mittels Lichtstreuung, die Stabilitätsprüfung durch gel-elektrophoretische Versuche (EMSA) und der Einfluss der hydrophoben Peptid-Domäne auf diese Eigenschaften.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist die systematische transientenkinetische Charakterisierung der Komplexbildung, um aufzuklären, wie hydrophobe Domänen in CPPs die Ausbildung stabiler Komplexe und damit die Transfektionseffizienz beeinflussen.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden Stopped-Flow-Spektroskopie zur Kinetik, Dynamische Lichtstreuung (DLS) zur Größenbestimmung, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) zur Stabilitätsprüfung sowie Autoradiographie und computergestützte Hydrophobizitätsanalysen verwendet.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil präsentiert die Ergebnisse der kinetischen Analysen, der Komplexgrößenbestimmung und der Stabilitätsnachweise für die verschiedenen untersuchten Peptid-Carrier (MPG-Familie, virale Fusionssequenzen) und deren Interaktion mit unterschiedlichen Nukleinsäure-Typen.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren diese Arbeit?
Zellpenetrierende Peptide, Komplexbildung, Stopped-Flow, Dynamische Lichtstreuung, Hydrophobizität, Transfektionseffizienz und Komplexstabilität.
Welche Bedeutung hat die hydrophobe Domäne für die Stabilität der Komplexe?
Die Arbeit zeigt, dass die hydrophobe Domäne essentiell ist; Peptide ohne diese Domäne bilden instabile oder gar keine Komplexe, während eine ausgeprägtere Hydrophobizität direkt mit einer höheren Stabilität und besseren Transfektionseffizienz korreliert.
Was sagen die EMSA-Ergebnisse über die Komplexe aus?
Die EMSA-Experimente zeigen, dass Komplexe, die durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert werden, einen deutlichen „Shift“ der Nukleinsäurebanden in nativen Gelen aufweisen, was auf eine stabile Bindung hinweist, die im Gegensatz zu rein elektrostatisch gebundenen Komplexen auch unter Belastung bestehen bleibt.
- Arbeit zitieren
- Hanno Sjuts (Autor:in), 2007, Charakterisierung der Komplexbildung zwischen Zellpenetrierenden Peptiden und Oligonukleotiden , München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/162062
