Thema 3: Einführung in die cDNA-basierte Microarraytechnologie
Nils Krugmann
Zusammenfassung: In der hier folgenden Ausarbeitung zum Thema wird die cDNA- Technologie als echte Alternative zur oligonukleotidbasierten Microarraytechnologie vorgestellt und erläutert. Nach Darstellung der grundlegenden Prinzipien und der Herstellungsphasen wie Chip-Entwurf und robotergestütztes Spotting wird auf die Hybridisierung und auf Kriterien zur Target-Gewinnung eingegangen. Die Auswertung der gewonnenen Daten sowie Hindernisse, die bei der Bilderkennung und Bildverarbeitung erkannt und umgangen werden müssen, leiten vor der Darstellung einer Fülle von Anwendungen das Ende der Ausarbeitung ein.
Der Autor kommt zum Ergebnis, dass diese Technologie eine ernsthafte Alternative zu kommerziellen Verfahren darstellt, da sie verwendende Labore unabhängig und günstig operieren können und diese Technik bereits weite Verbreitung und Unterstützung gefunden hat.
1 Einleitung
Die Technologie der rekombinanten DNA hat die Biologie revolutioniert, aber es ha ndelt sich nicht um die einzige Revolution. Eine andere basiert auf der Technologie des Siliziumchips, die an den Gebrauch in der Genomanalyse angepasst wurde.
In den frühen neunziger Jahren entdeckte man, dass der Prozess, mit dem sich Comp uterchips herstellen lassen (Fotolitografie), so abwandeln lässt, dass man Chips mit Ta usenden verschiedener DNA-Fragmente bekannter Sequenz herstellen kann.
Ein Microarray ist ein winziger Objektträger aus Glas oder Nylon mit etwa 1-2 cm Lä nge. Der Glasträger besitzt eine Ähnlichkeit zu den bei Lichtmikroskopen verwendeten Objektträgern, aber die Nylon-Träger sind grösser.
Neben dieser (stark kommerzialisierten) oligonukleotid-basierten Arraytechnologie hat sich zunehmends die cDNA-Technologie durchgesetzt, die vorrangig im Forschungsund Kleinlabor-Bereich eingesetzt wird. Gegenwärtig erlaubt die Technik eine Herstellung von Hunderttausender unterschiedlicher DNAs bekannter Sequenz in einem Bereich von 1-2 cm eines Chips anzuordnen. So lassen sich DNA-Chips produzieren, die beispielsweise alle 6.200 bekannten proteincodierenden Gene der Hefe Saccharomyces cereviviae repräsentieren. Dabei wird jedes DNA-Stück auf dem Objektträger verankert.
Diese DNA-Chips können dann mit DNA- oder RNA-Proben hybridisiert werden, die man mit Fluoreszenzfarbstoffen oder auf andere Art markiert hat. Der Chip wird dann mit Hilfe eines Laserscanners oder einer CCD-Kamera ausgelesen und von einem Rechner analysiert. Abhängig davon, welche komplementären RNA- oder DNA- Sequenzen in der Probe vorhanden sind, beobachtet man ein ganz unterschiedliches Hybridisierungsmuster (Abb. 1).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.1.: Das Foto zeigt einen Teil des gesamten Genoms der Hefe (Saccharomyces cerevisiae), das man auf einen cDNA-Chip gebunden hat. Jedes Gen ist in mehreren Kopien vorhanden und wurde mit fluoreszenzmarkierter cDNA aus Hefezellen, die man unter spezifischen Bedingungen kultiviert hat, hybridisiert. Stellen, wo die cDNA an DNA gebunden hat, sind an einer Farbskala erkenntlich, die bis zu rot bzw. grün reicht, was eine maximale Hybridisierung anzeigt. Da man die genauen Stellen kennt, wo sich die spezifischen Gene auf dem Chip befinden, kann man die spezifische Genexpression ableiten, sobald der Chip gelesen wurde.
cDNA-Microarrays sind in der Lage, tausende von Genexpressionsanalysen in einem einzigen Experiment durchzuführen. Dazu wird DNA auf einem Glasslide verankert und mit fluoreszenzoder radioaktiv markierter cDNA hybridisiert.
2 Prinzipien und Entwicklung von cDNA-basierten Arrays
2.1 Unterschiede zu herkömmlichen Methoden
Konzeptionell besteht kein Unterschied zwischen herkömmlichen Hybridisierungsexperimenten wie Southern Blotting (DNA-Proben werden dabei auf einem Filter von bekannten Sequenzen aufgetrennt) oder Northern Blotting (RNA-Proben werden auf einem Filter aufgetrennt).
Bei Microarrayexperimenten wird die Sonde direkt mit dem Trägermaterial verbunden und die Informationsmenge, die in einem einzigen Experiment gesammelt werden kann, ist wesentlich grösser.
Weitere Vorteile der Microarraytechnologie liegen in der Verwendung von durch Fluoreszenzfarbstoffe markierter Proben, wohingegen bei klassischen Blotting-Versuchen meist radioaktiv markierte Proben verwendet werden1. Des weiteren bedarf es nicht der aufwendigen Herstellung per Hand im Labor, sondern eine vollautomatisierte Herstellung durch Roboter ist möglich.
Obwohl die cDNA-Technologie sehr ähnlich zur Oligonukleotidarraytechnologie ist, bringt die Verwendung von cDNA Microarrays einige Vorteile mit sich, die in der technischen Unabhängigkeit der sie verwendenden Labors liegt.
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Häufig gestellte Fragen
Was ist das Thema der Ausarbeitung "Einführung in die cDNA-basierte Microarraytechnologie"?
Die Ausarbeitung behandelt die cDNA-Technologie als Alternative zur oligonukleotidbasierten Microarraytechnologie. Sie beschreibt die grundlegenden Prinzipien, Herstellungsphasen (Chip-Entwurf, robotergestütztes Spotting), Hybridisierung, Kriterien zur Target-Gewinnung, Datenauswertung und Anwendungen.
Was ist ein Microarray?
Ein Microarray ist ein kleiner Objektträger aus Glas oder Nylon (ca. 1-2 cm groß) mit Tausenden von DNA-Fragmenten bekannter Sequenz.
Worin besteht der Unterschied zwischen cDNA- und Oligonukleotid-basierten Microarrays?
Während Oligonukleotid-basierte Microarrays stark kommerzialisiert sind, wird die cDNA-Technologie hauptsächlich im Forschungs- und Kleinlaborbereich eingesetzt. cDNA Microarrays bieten den Vorteil der technischen Unabhängigkeit für die Labore, die sie verwenden.
Wie funktionieren cDNA-Microarrays?
DNA wird auf einem Glasslide verankert und mit fluoreszenz- oder radioaktiv markierter cDNA hybridisiert. Die Genexpression wird durch Analyse des Hybridisierungsmusters bestimmt.
Was sind die Vorteile der Microarraytechnologie gegenüber herkömmlichen Methoden wie Southern oder Northern Blotting?
Bei Microarrayexperimenten wird die Sonde direkt mit dem Trägermaterial verbunden, wodurch eine größere Informationsmenge in einem einzigen Experiment gesammelt werden kann. Außerdem werden oft Fluoreszenzfarbstoffe anstelle von radioaktiven Markierungen verwendet, und die Herstellung kann automatisiert werden.
Welche Anwendungen haben cDNA-Microarrays?
cDNA-Microarrays ermöglichen es, tausende von Genexpressionsanalysen in einem einzigen Experiment durchzuführen.
Welche Schlussfolgerung zieht der Autor bezüglich der cDNA-Technologie?
Der Autor kommt zu dem Schluss, dass diese Technologie eine ernstzunehmende Alternative zu kommerziellen Verfahren darstellt, da sie es den verwendenden Laboren ermöglicht, unabhängig und kostengünstig zu arbeiten, und sie bereits weit verbreitet und unterstützt wird.
- Arbeit zitieren
- Nils Krugmann (Autor:in), 2002, Einführung in die cDNA-basierte Microarraytechnologie, München, GRIN Verlag, https://www.hausarbeiten.de/document/107012
