Klonierung des Hefe-Gens sba 1. Praktikumsbericht mikrobielle Gentechnologie

Inhaltsverzeichnis

I) Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens
Einleitung
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion

II) Versuch: Ortsspezifische Mutagenese
Einleitung
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Literatur

I) Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens

Einleitung

Im vorliegenden Versuch wird die Klonierung des Hefe-Gens sba1 erzielt.

Materialien und Methoden

Diese wurden wie beschrieben im Skript verwendet bzw. durchgeführt. Abweichungen vom Skript sind:

Bei der Zugabe von Lyticase wurde eine Endkonzentration von 40U/ml angesetzt statt 20U/ml [S. 6, 1.) Präparation von chromosomaler (genom.) DNA aus Hefe].

Bei der PCR mit (verdauter) genomischer Hefe DNA wurden 26 Zyklen statt 30 durchgeführt. [S.8, 3.) PCR mit (verdauter) genomischer Hefe DNA]

Bei der AGE der PCR-cDNA-Fragmente wurde der Ansatz des eigenen, gereinigten und verdauten PCR-cDNA-Fragments (Ansatz 1) auf 2 Geltaschen verteilt, jeweils auf 25µl und 20µl. [S.10, 7.)Gelreinigung der PCR-cDNA-Fragmente, Agarosegelelektrophorese]

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Kontrolle von präpariertem Hefe-gDNA und die mittels PCR hergestellten cDNA-Fragmente in Agarosegel. Template für die PCR war entweder die im Versuch präparierte, genomische Hefen-gDNA (eigene gDNA) oder eine aus einer Firma fertiggekaufte Hefen-gDNA (gestellte gDNA).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Gelfoto 1, Gelanalyse der gDNA und PCR-cDNA. Kontrolle der Präparation von Hefe-gDNA mit unterschiedlichen Behandlungen (A-C) und der mittels PCR synthetisierten cDNA-Fragmente (D-F).

(0) Mass Ruler, Größenstandard.

(A) Aliquot 1 (gDNA, unverdaut).

(B) Aliquot 2 (gDNA, SalI verdaut).

(C) Aliquot 3 (gDNA, SalI verdaut, RNase A behandelt).

(D) PCR-Ansatz 1 (eigene Hefe-gDNA).

(E) PCR-Ansatz 2 (pos. Kontrolle: gestellte Hefe-gDNA).

(F) PCR-Ansatz 3 (neg. Kontrolle: ohne gDNA-Template)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2 zeigt die PCR-produzierten cDNA-Fragmente („eigene PCR-cDNA“ aus eigener gDNA und „gestellte PCR-cDNA“ aus gestellter gDNA) und das Plasmid pMPM 88B in Agarosegel. Beide wurden mit XhoI und BamHI verdaut.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1 zeigt die Anzahl an Kolonien der jeweiligen Transformationsansätze aller Kursteilnehmer.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1, Transformationsraten. 200µl und 300µl ist das ausplattierte Volumen auf LB-Platten. Fettgedrückte Zahlen stellen meine Ergebnisse dar. Ansatz 1: eigene Vektor-DNA (pBS) mit eigenem cDNA-Fragment (Insert). Ansatz 2: eigene Vektor-DNA (pBS) ohne cDNA-Fragment (Insert). Ansatz 3: eigene Vektor-DNA (pBS) mit gestelltem cDNA-Fragment (Insert). Ansatz 4: gestellte Vektor-DNA (pBS) mit eigenem cDNA-Fragment (Insert). Ansatz 5: gestellte Vektor-DNA (pBS) mit gestelltem cDNA-Fragment (Insert).

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