Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für ein europäisches Projekt (EPICURE) acht Kandidatengene bezüglich der idiopathisch generalisierten Epilepsie (IGE), einer zum Teil erblichen Störung des zentralen Nervensystems (ZNS), in einem europäischen Kollektiv aus acht Ländern untersucht.

Durch Sequenzierung der Kandidatengene und Durchführung einer Kosegregationsanalyse konnte im Gen CACNA1I eine neue DNA-Variante entdeckt werden, die eventuell in der Lage ist, IGE auszulösen oder zumindest zu beeinflussen. Eine bereits bekannte, IGE-assoziierte Variante im Gen KCNJ10 mit der dbSNP-ID rs1130183 konnte zudem bestätigt und vorherige Ergebnisse repliziert werden.

II

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis   

ZUSAMMENFASSUNG   II

INHALTSVERZEICHNIS.................................................................................................................................   III

ABBILDUNGSVERZEICHNIS   V

TABELLENVERZEICHNIS   VI

ABK  ÜRZUNGEN  VII

1.  EINLEITUNG  1

1.1  GENETIK DER IDIOPATHISCH GENERALISIERTEN EPILEPSIEN  1

1.2  KLASSIFIKATION DER IGE-SYNDROME  2

1.3  KENNTNISSTAND DER MOLEKULARGENETISCHEN ANALYSEN BEI IGE  3

1.3.1  Monogene idiopathische Epilepsien  4

1.3.2  Idiopathische Epilepsien mit komplexer genetischer Disposition  6

1.4  KOPPLUNGSANALYSEN  7

1.5  ASSOZIATIONSANALYSEN  8

1.5.1  Genom-weite Assoziationsstudien  8

1.6  SEQUENZANALYSEN VON KANDIDATENGENEN  9

1.7  ZIELSETZUNG  10

2.  MATERIAL UND METHODEN  11

2.1  STUDIENPROBANDEN UND MATERIAL  11

2.1.1  Patienten und Kontroll-DNA  11

2.1.1.1  Proben für Sequenzanalyse der Kandidatengene  11

2.1.1.2  Studienkollektive der Assoziationsstudie  12

2.1.2  Chemikalien, Enzyme und Kits  12

2.1.3  Verwendete Geräte  12

2.1.4  Verwendete Verbrauchsmaterialien  14

2.1.5  Verwendete Programme und Datenbanken  15

2.2  METHODEN  17

2.2.1  DNA-Konzentrationsbestimmung  17

2.2.2  TaqMan RNase  17

2.2.3  DNA-Normalisierung.  19

2.2.4  Polymerase Kettenreaktion.  19

2.2.5  Agarose Gel-Elektrophorese  20

2.2.6  Sequenzanalysen der Kandidatengene.  21

2.2.6.1  Auswahl der Kandidatengene  21

2.2.6.2  Sequenzanalyse nach Sanger  21

2.2.7  Pyrosequenzierung  22

2.2.8  GenomeLab SNPstream  24

2.2.8  Einschätzung der Studienteststärke  25

2.2.9  Plausibilitätsprüfungen potentiell pathogener Sequenzvarianten  25

2.2.10  Statistische Methoden  27

3.  ERGEBNISSE  28

3.1  SEQUENZANALYSE DER KALIU-MKANALGENE KCNJ8, KCNJ9 UND KCNJ10  28

3.2  SEQUENZANALYSE DES GABA-REZEPTOR-GENS GABRR1.  29

3.3  SEQUENZANALYSE DES NA -K -2CL - -TRANSPORTER-GENS SLC12A2  30

3.4  SEQUENZANALYSE DES KALZIU-MKANAL-GENS CACNA1I  31

3.4.1  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.920G A (p.Arg307His)  33

3.4.2  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.1513C A (p.His505Asn)  33

3.4.3  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.3077C T (p.Pro1026Leu)  34

3.4.4  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.3579G C (p.Gln1193His)  35

3.4.5  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.3698A C (p.Gln1233Pro)  36

3.4.6  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.5285C T (p.Pro1762Leu)  36

3.4.7  Kosegregationsanalyse von CACNA1I c.6118G T (p.Asp2040Tyr)  38

III

Inhaltsverzeichnis

3.4.8  Überprüfung der Variationen im Kontroll-Kollektiv  38

3.5  SEQUENZANALYSE DES KALZIU-MKANAL-GENS CACNA1H  39

3.6  SEQUENZIERUNG VON NLGN4X.  41

3.7  ASSOZIATIONSANALYSEN  42

4.  DISKUSSION  44

4.1  STUDIENSTRATEGIEN  44

4.2  SEQUENZANALYSE  46

4.3  ASSOZIATIONSSTUDIEN  51

4.4  METHODISCHE ERÖRTERUNGEN.  51

4.4.1  Fehlerquellen.  52

4.5  ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK.  54

5.LITERATURVERZEICHNIS   56

6.  ANHANG.  64

DANKSAGUNG.   70

IV

Abbildungsverzeichnis   

Abbildungsverzeichnis   

Abbildung  1.1: Klassifikation von idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE)  

Abbildung  1.2: Disposition der genetisch komplexen Epilepsien als  

quantitatives  Erbmerkmal  

Abbildung  2.1: Ablauf vom TaqMan -Assay  

Abbildung  2.2: Schema der Reaktionskaskade während der Sequenzierung  

Abbildung  2.3: Ablauf vom SNPstream -Assay  

Abbildung  2.4: Schrittweise Plausibilitätsprüfung potentiell pathogener  

Sequenzvarianten   

Abbildung  3.1: Stammbaum der Familie mit Variation c.920G A  

Abbildung  3.2: Stammbäume der Familien mit Variation c.1513C A  

Abbildung  3.3: Stammbaum der Familie mit Variation c.3077C T  

Abbildung  3.4: Stammbaum der Familie mit Variation c.3579G C  

Abbildung  3.5: Stammbaum der Familie mit Variation c.3698A C  

Abbildung  3.6: Stammbäume der Familien mit Variation c.5285C T  

Abbildung  3.7: Stammbaum der Familie mit Variation c.6118G T  

Abbildung  3.8: Clusterplotts vom SNPstream vom SNP rs1130183  

Abbildung  4.1: Paradigma von VAPSE-basierten Studien  

Abbildung  4.1: Überblick über in silico Analysen  

V

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Erkrankungsgene bei monogenen Epilepsie-Formen 5

Tabelle 2.1: Übersicht der untersuchten IGE-Patienten 11

Tabelle 2.2: Verwendte Programme und Datenbanken 15

Tabelle 2.3: Genomische Informationen der sequenzierten Kandidatengenen 21

Tabelle 3.1:

Identifizierte Sequenzvariationen des Gens GABRR1 Tabelle 3.2: 29

Identifizierte Sequenzvariationen des Gens SLC12A2 Tabelle 3.3: 30

Identifizierte Sequenzvariationen des Gens CACNA1I Tabelle 3.4: 32

Tabelle 3.5:

Identifizierte Sequenzvariationen des Gens CACNA1H Tabelle 3.6: 39

Identifizierte Sequenzvariationen des Gens NLGN4X Tabelle 3.7: 41

Tabelle 3.8:

Tabelle 3.9: Sequenzvariationen mit Genotypisierungsqualitätswerte 43

Tabelle 3.10: Assoziationsstatistiken 43

Tabelle 5.1: Verwendete Primer für Sanger-Sequenzierung 64

Verwendete Primer für Pyrosequenzierung CACNA1I Tabelle 5.2: 67

Verwendete Primer für SNPstream-Assay Tabelle 5.3: 67

VI

Abkürzungen

® Amtlich registrierte Marke °C Grad Celsius μ Mikro A Adenosin AA homozygote AB heterozygote Abb. Abbildung AF Allelfrequenz Amp Amplifikation AS Aminosäure ATP Adenosin-Tri-Phosphat bp Basenpaare C Cytosin Chr Chromosom CTP Cytosin-Tri-Phosphat dATP didesoxy-Adenosin-Tri-Phosphat dCTP didesoxy-Cytosin-Tri-Phosphat dd di-destilled, zweifach destilliert ddNTP Diesoxynukleotid-5'-triphosphat Del Deletion dGTP didesoxy-Guanin-Tri-Phosphat DNA Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotid-5'-triphosphat dTTP didesoxy-Thymin-Tri-Phosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alii (m), et aliae (f), et alia (n) (lat.): und andere FRET Fluorescence resonance energy transfer Fwd Forward G Guanin

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g Gramm GTP Guanin-Tri-Phosphat IGE Idiopathisch generalisierte Epilepsie The International League Against Epilepsy ILAE kb Kilobasenpaare l Liter m Mili bzw. Meter M Molarität Mb Megabasenpaare min Minute mol Mol mRNA Messenger RNA n Nano NCBI National Center for Biotechnology Information NTP Nukleotid-5'-triphosphat OMIM Online Mendelian Inheritance in Man PCR Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion PPi Pyrophosphat Rev Reverse RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure SAPE Streptavidin Phycoerythin SNP Sinlge Nucletide Polymorphism T Thymin Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA Taq Thermus aquaticus TM Trademark Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan rtPCR Real Time PCR untranslated region UTR UV Ultra-Violett V Volt

Variants affecting protein structure or expression VAPSE ZNS Zentrales Nervensystem

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1. Einleitung

1.1 Genetik der idiopathisch generalisierten Epilepsien

Epilepsien gehören mit einer Prävalenz von 3% zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (Hauser, et al., 1996). Das Krankheitsbild Epilepsie umfasst eine heterogene Gruppe von Störungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die klinisch durch das wiederholte Auftreten von unprovozierten epileptischen Anfällen gekennzeichnet sind, denen neurophysiologisch eine paroxysmal auftretende, synchronisierte zerebrale

Erregungssteigerung zugrunde liegt (ILAE, 1989). Als Anfall wird eine vorübergehende Beeinträchtigung der Hirnfunktion bezeichnet, die sich plötzlich entwickelt und spontan endet (Hauser, et al., 1996). Ein epileptischer Anfall wird durch eine synchrone Erregungssteigerung von Neuronenverbänden des ZNS ausgelöst. Anhand

elektroenzephalographischer (EEG) Untersuchungen können die Erregungssteigerungen im Gehirn erfasst werden.

Bei ca. 50% aller Epilepsien sind vorwiegend genetische Faktoren als Krankheitsursache determiniert. Dies gilt besonders für die häufigen idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE), die ca. 30% aller Epilepsien repräsentieren (Sander, 2003). Epileptische Anfälle stellen bei IGE das einzige Erkrankungssymptom dar, wobei der Verlauf und die Symptome keine Hinweise auf eine anatomisch begrenzte Lokalisation im Gehirn geben und keine Zeichen eines lokalen Beginns zu erkennen sind. Es gibt keine Hinweise auf exogene Faktoren (Hirntrauma, perinatale Hirnschädigung, Encephalitis, Hirnmißbildung, Tumor, etc.) zur Ätiologie der IGE (ILAE, 1989).

Die IGEs werden aufgrund von Konkordanzraten (80% bei eineiigen Zwillingen und von 5-8% bei Geschwistern) als zum Großteil genetisch bedingte Krankheit betrachtet (Berkovic, et al., 1998; Ottman, 2005). Das relative Geschwisterrisiko ist 10-20x höher als das der Gesamtbevölkerung (Gardiner, 2005). Zusätzlich weisen IGE-Syndrome einen altersabhängigen Erkrankungsbeginn auf (Berkovic, et al., 1987).

Da die IGE phänotypisch eindeutig charakterisierbar und ihre Ätiologie vorwiegend genetisch determiniert ist, sind molekulargenetische Forschungsansätze aussichtsreich, bei denen die Identifizierung der verantworstlichen Gene einen bedeutenden Anteil zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Epileptogenese leistet.

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1.2 Klassifikation der IGE-Syndrome

Gemäß der Klassifikation der Internationalen Liga gegen Epilepsie (ILAE, 1989) werden IGE-Syndrome anhand des Anfalltyps, des Manifestationsalters und des Krankheitsverlaufs klassifiziert (Abbildung 1.1). Die molekulargenetischen Analysen in dieser Arbeit befassen sich mit den drei häufigsten IGE-Syndromen: Der Absence Epilepsie des Kindesalters (CAE), der juvenilen Absence Epilepsie (JAE) und der juvenile myoklonischen Epilepsie (JME). Diese Syndrome stellen ca. 50% aller IGE dar (Duncan, 1997; Janz, 1997). Zusammen mit der Aufwach-„grand mal“-Epilepsie bilden sie sogar 80% aller IGE.

Die Absence Epilepsie des Kindesalters (chilhood absence epilepsy, CAE) manifestiert sich im Schulkindalter (3. bis 12. Lebensjahr). Bei einem Absence-Anfall (Petit mal, „kleiner Anfall“) steht ein abrupter Aufmerksamkeits- und Reaktionsverlust gegenüber der Umgebung im Vordergrund, der jedoch ohne Sturz oder Merkmale der Bewusstlosigkeit einhergeht. Es handelt sich um die mildeste Ausprägung generalisierter Anfälle. Nach dem Anfall erfolgt die unvermittelte Aufnahme der zuvor unterbrochenen Tätigkeit (Berkovic, et al., 1987). Im Krankheitsverlauf treten die Anfälle häufig mehrfach täglich (pyknoleptisch) auf (Loiseau, 1992).

Der Anfallsbild der Juvenile Absence Epilepsie (juvenile absence epilepsy, JAE) ist der CAE ähnlich. Das Manifestationsalter liegt zwischen dem 8. und 20. Lebensjahr. Während des Erkrankungsverlaufs werden sporadische, vereinzelt auftretende Absencen beobachtet. Etwa 16% der Patienten erleiden myoklonische Anfälle (Wolf und Inoue, 1984).

Die Juvenile Myoklonische Epilepsie (juvenile myoclonic epilepsy, JME) beginnt meist zwischen dem zwölften und achtzehnten Lebensjahr und ist durch bilaretale, meist wiederholt auftretende Muskelzuckungen der Schultern und Arme charakterisiert. Das Bewusstsein ist aufgrund der Kürze des Anfalls nicht beeinträchtigt. Bei 30% der Patienten beginnt die Epilepsie mit Absence-Anfällen. Schlafentzug, Photostimulation, Hyperventilation, emotionaler Stress, Alkohol und in einigen Fällen Menstruation können die Auslösung eines Anfalls begünstigen (Janz, 1985; Wolf und Goosses, 1986).

Die Aufwach-„grand mal“-Epilepsie (epilepsy with generalized grand mal on awakening, EGMA) ist durch generalisierte, tonisch-klonische Anfälle charakterisiert, die tageszeitlich gebunden sind und in den ersten Stunden nach dem Aufwachen auftreten.

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Abbildung 1.1: Klassifikation von idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE)

Die verschiedenen IGE-Syndrome weisen ein charakteristisches Erkrankungsalter auf. Das Anfallsbild korreliert mit dem Entwicklungs- und Reifungsgrad des Gehirns (Berkovic, et al., 1987) und ändert sich mit fortschreitender Reifung der zerebralen Funktionssysteme. Hierbei können die Anfälle dauerhaft anhalten oder sich in andere Anfallsformen entwickeln (Wirrell, et al., 1996). Bei etwa 20% der IGE-Patienten ist das zeitlich aufeinanderfolgende Auftreten von Absencen und myoklonischen Anfällen zu beobachten. Neurobiologisch betrachtet überlappen die IGE-Subtypen.

1.3 Kenntnisstand der molekulargenetischen Analysen bei IGE

Obwohl die Ätiologie der IGE fast vollständig genetisch bestimmt wird, ist ihre molekulargenetische Architektur kaum bekannt. Bei ca. 1-2% aller IGE verursacht ein einzelner Gendefekt die Erkrankung. Bei den meisten IGE wird von einer komplexen genetischen Ätiologie ausgegangen, bei der mehrere genetische Faktoren an der Epileptogenese beteiligt sind (Gardiner, 2005; Ottman, 2005). Erst wenn die Summe der Effekte mehrerer genetischer Störungen eine gewisse Erkrankungsschwelle überschreitet, kommt es zur Manifestation einer Epilepsie (Zimprich, 2006) (Abb. 1.2).

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Abbildung 1.2: Disposition der genetisch komplexen Epilepsien als quantitatives Erbmerkmal

1.3.1 Monogene idiopathische Epilepsien

Mittels des molekulargenetischen Verfahrens der positionellen Klonierung konnten bei mehreren autosomal dominant vererbbaren IGE-Syndromen siebzehn Epilepsie-Gene identifiziert werden (Helbig, et al., 2008) (Tabelle 1.1). Die meisten dieser Gene kodieren für neuronale Ionenkanäle. Die monogenen Epilepsien werden daher auch zu den Ionenkanal-Erkrankungen gezählt. Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion im ZNS. Die bisher identifizierten Ionenkanalgene weisen eine starke Heterogenität auf.

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Tab. 1.1 Erkrankungsgene bei monogenen Epilepsie-Formen

Legende: ADNFLE, autosomal dominante nächtliche Frontallappen-Epilepsie; ADPEAF, dominante

partielle Temporallappen-Epilepsie mit auditorischer Aura; BFNC, benigne familiäre neonatale

Anfälle; CAE, Absence-Epilepsie des Kindesalters; GEFS+, generalisierte Epilepsie mit

Fieberkrämpfen plus; GEPD, generalisierte Epilepsie mit paroxysmaler Dyskinesie; IPE, idiopathisch

partielle Epilepsie; JME, juvenile myoklonische Epilepsie.

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Bislang konnten Mutationen in drei Genen der Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten (CHRNA4, CHRNA2, CHRNB2) für die autosomal dominante nächtliche Frotntallapenepilepsie (ADNFLE) nachgewiesen werden. Die klassischen Mutationen, z.B. „nicht-synonyme“ - oder „frame-shift“- Mutationen, kommen in Genabschnitten vor, welche zur Kodierung der Ionenkanalpore zuständig sind. Die generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus (GEFS+) wird durch Mutationen in Genen, die für spannungsabhängige Natriumkanäle (SCN1A, SCN1B, SCN2A) bzw. GABA-Reteptor-Untereinheiten (GABRG2, GABRD) kodieren, determiniert. Es wurden zwei Gene, für Kaliumkanäle kodierend (KCNQ2, KCNQ3), bei benignen familiären neonatalen Anfällen identifiziert. Als Ursache der idiopathisch partiellen Epilepsie und generalisierten Epilepsie mit paroxysmaler Dyskinesie fanden sich Mutationen in KCNA1 und KCNMA1, die ebenfalls Kaliumkanäle kodieren. Mehrere nicht-synonyme Mutationen in CACNA1H, das zuständige Gen für T-Typ Kalziumkanäle, können Absence-Epilepsie des Kindesalters auslösen. In einzelnen Familien mit autosomal dominant vererbter juveniler myoklonischer Epilepsie fanden sich Mutationen in Genen, die für Kalziumkanäle (CACNB4) bzw. eine GABA-Rezeptor-Untereinheit (GABRA1) und Protein mit einem EF-Hand Motiv (EFHC1) kodieren. Das Gen LGI1, in dem bei Patienten mit autosomal dominanter Partialepilepsie mit auditorischen Symptomen (ADPEAF) Mutationen festgestellt wurden, kodiert keinen Ionenkanal. Insgesamt ist eine ausgeprägte phänotypische und genotypische Heterogenität auffällig (Cooper, et al., 2000; Lerche, et al., 2001).

1.3.2 Idiopathische Epilepsien mit komplexer genetischer

Disposition

Die molekulargenetische Aufklärung der genetisch komplexen Dispositionen der häufigen IGE-Formen befindet sich erst in der Anfangsphase. Kopplungsanalysen, Assoziationsstudien sowie Sequenzanalysen von Kandidatengenen repräsentieren drei sich ergänzende Strategien zur molekulargenetischen Analyse von IGE-Syndromen (Glazier, et al., 2002). Kopplungsstudien sind sehr erfolgreich bei der positionellen Kartierung von Mutationen mit starkem Effekt. Assoziationsstudien sind die Methode der Wahl zur Identifizierung von häufigen Genvarianten mit nur geringen Effekten, wie sie gemäß der Common Disease/Common Variant (CDCV) Hypothese erwartet werden. Ergänzend sind Sequenzanalysen von plausiblen Kandidatengenen in der Lage, bei Vorliegen einer

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ausgeprägten allelischen Heterogenität auch multiple, seltene Genmutationen zu erfassen, die an der Epileptogenese beteiligt sind (Common Disease/Multiple Rare Variants Hypothese).

1.4 Kopplungsanalysen

Zur positionellen Klonierung von Erkrankungsgenen werden nach der Bestimmung der chromosomalen Region der verantwortlichen Genstörung potentielle Erkrankungsgene in der Kandidatengenregion kloniert. Der Vergleich zwischen genetischen Merkmalen innerhalb der Familie erlaubt die Identifizierung eines chromosomalen Abschnittes, der gemeinsam mit der Erkrankung an betroffene, nicht aber an gesunde Nachkommen vererbt wird. Innerhalb einer solch gekoppelten Region kann dann die krankheitsverursachende Mutation durch die Sequenzanalyse von Kandidatengenen ermittelt werden.

Das Prinzip der Kopplungsanalyse basiert auf einem strukturellen Umbau der Chromosomen durch den Austausch homologer Chromosomenabschnitte während der Meiose I der Keimzellbildung. Aufgrund der linearen Anordnung der Gene auf der chromosomalen DNA werden Gruppen von Allelen, die auf demselben kurzen Chromosomenabschnitt liegen, in einem Stammbaum gemeinsam (physikalisch gekoppelt) vererbt. Je weiter zwei Loci auf einem Chromosom voneinander entfernt sind, umso größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese durch ein Crossing-over getrennt werden. Die Rekombinationshäufigkeit ist somit ein Maß für die positionelle Entfernung verschiedener Loci. Zur Lokalisation des Krankheitsgens durch molekulargenetische Kopplungsanalyse werden statistische Verfahren angewendet, die die Wahrscheinlichkeit einer gekoppelten Vererbung in Beziehung zu einer zufälligen Mendelschen Transmission ermitteln. Häufig werden für Kopplungsanalysen Mikrosatelliten und Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphism, SNP) als informative Marker verwendet. Obwohl die Kopplungsstudien hypothesenfrei einen Erkrankungslocus ermitteln können, ist deren Effizienz bei Vorliegen zahlreicher Erkrankungsloci (Locus-Heterogenität) gering.

Durch Kopplungsanalysen konnten IGE-Loci auf mehreren chromosomalen Segmenten (2q36, 3q26, 5p15, 5q22, 6p12, 6p23.1, 7q14, 8p12, 8q24, 11q13, 13q31, 14q23, 15q14, 18q21, 19q13) lokalisiert werden (Sander, et al., 2000; Durner, et al., 2001; Tauer, et al., 2005). Da aber die Mehrzahl dieser Loci in relativ kleinen Familien-Kollektiven (n < 50-120) festgestellt wurden, konnten die Replikationsstudien die ermittelten Phänotyp-Genotyp-

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Beziehungen nicht bestätigen. Dies deutet darauf hin, dass sehr grosse Familienkollektive für diese Studien benötigt werden. Bisher konnten bei den häufigen, genetisch komplexen IGE Syndromen die IGE-Gene BRD2 EFHC1, und ME2 identifiziert werden (Turnbull, et al., 2005).

1.5 Assoziationsanalysen

Genetische Assoziationen basieren auf dem Nachweis einer statistischen Häufung einer Sequenzvariation bei Erkrankten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Ein mit der Krankheit assoziiertes Allel oder Locus in der Nähe eines assoziierten Allels kann das Risiko einer Erkrankung beeinflussen. Bei letzterem Fall spricht man von einem Kopplungsungleichgewicht eines Markerallels mit dem Allel des Erkrankungsgens. Entsprechend der CDCV-Hypothese (Reich, et al., 2001), spielen bei den meisten IGE-Patienten die Kombination verschiedener, häufiger Genvarianten mit kleinen Effekten eine ausschlaggebende Rolle, welche nicht durch Kopplungsanalysen detektierbar sind. Bei zahlreichen (n > 60) Assoziationsstudien von Kandidatengenen bei Epilepsien konnten einige positive Assoziationsbefunde festgestellt werden (BRD2, CACNA1A, CACNA1H, CACNG3, CHRNA4, CX36, EFHC2, GLUR5, GABRB3, KCNJ3, KCNJ6, KCNJ10, KCNMB3, LGI4, ME2, OPRM1) (Tan, et al., 2004). Bisher konnte aber nur die Assoziation der Gene KCNJ10 (Kalium-Kanalgen) und CX36 (Gen zur Kodierung neuronaler Zellbrückenproteins Connexin-36) mit IGE bestätigt werden (Lenzen, et al., 2005).

1.5.1 Genom-weite Assoziationsstudien

Mit modernen Hochdurchsatz-Genotypisierungsverfahren ist es möglich, eine große Anzahl (> 1 Mio. SNPs) von genetischen Varianten zu bestimmen. Einer der häufigsten Sequenzpolymorphismen sind SNPs. Im gesamten menschlichen Genom tritt ca. alle 1000 Basenpaare ein SNP auf, die Anzahl der bekannten SNPs beträgt mehrere Millionen. Bei genomweiten Assoziationsstudien werden eine große Anzahl von SNPs (ca 1.000.000), verteilt über das gesamte Genom, in einem Patienten- und Kontrollkollektiv genotypisiert und die Allelfrequenzen durch statistische Verfahren verglichen. Das Ziel dabei ist, genetische Varianten zu entdecken, die mit der betreffenden Erkrankung assoziiert sind. Eine unterschiedliche Allelfrequenz in beiden Kollektiven weist auf eine Assoziation mit dem entsprechenden Phänotyp hin. Um falsch-positive Assoziationen, z.B. durch systematische

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