Inhaltsverzeichnis:

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1.)  Einleitung:  3

1.1.)  Modellorganismus Maus (Mus musculus):  3

2.)  Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese:  4

2.1.)  Zielsetzung und Methode:  4

2.2.)  Vorbereitung der Fibroblasten: 1.Tag) Trypsinieren und Aussäen von Fibroblasten  

  (siehe Anhang):  6

2.2.1.)  Erwartungen:  7

2.2.2.)  Ergebnisse:  7

2.3.)  Durchführung der Transfektion und Transduktion am 2. Tag:  7

2.3.1.)  Durchführung der Transfektion (siehe Anhang):  7

2.3.2.)  Durchführung der Transduktion (siehe Anhang):  8

2.4.)  Mediumwechsel, Fixierung und X-Gal-Färbung am 3. bzw. 5.Versuchstag (siehe  

Anhang):   8

2.4.1.)  Mediumwechsel:  8

2.4.2.)  Fixierung und X-Gal-Färbung der Zellen:  8

3.)  Ergebnisse:  9

3.1.)  Transfektion:  9

3.2.)  Transduktion:  9

4.)  Auswertung:  10

Literaturverzeichnis  :  13

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1.) Einleitung:

In diesem ersten Praktikumsteil soll das Prinzip der konditional gezielten Mutagenese in eukaryotischen Zellen vorgestellt werden. Unter einer Mutagenese versteht man die induzierte Mutationsauslösung. Eine Analyse von Mutanten ermöglicht wichtige Einblicke in den Bau und die Funktion von Genen. Das übliche Vorgehen ist die Beschreibung der Auswirkungen von Mutationen auf Reaktionen der betroffenen Zellen oder des betroffenen Organismus. Daraus folgt dann die Isolierung des Gens mit der Bestimmung seiner Struktur durch Nucleotid-Sequenzierung.

In diesem Versuchsteil wird die Methode des Conditional Gene Targeting benutzt, mit der es möglich ist, in der Maus gezielt zeit- und gewebespezifisch Gene auszuschalten. So eine Inaktivierung bildet sozusagen einen Funktionstest für das entsprechende Gen.

1.1.) Modellorganismus Maus (Mus musculus):

Die Maus stellt ein Modellorganismus dar, der in der Forschung einen besonderen Platz einnimmt, weil über 90% der Gene von Maus und Mensch ähnliche Strukturen haben und ähnliche Funktionen ausüben. Deswegen können Erkenntnisse aus Untersuchungen an der Maus unmittelbar dem Verständnis der menschlichen Physiologie oder Pathologie dienen. Dazu kommen experimentelle Vorteile, die Mäuse als Modellorganismen aufweisen.

Konditionale gezielte Mutagenese in eukaryontischen Zellen Seite 02

Man nutzt dabei die Methode des Conditional Gene Targeting. Die Grundidee dieser Methode ist es, das zu untersuchende Gen auszuschalten, um dessen Funktion zu erkennen. Als Versuchsobjekt dient dabei die Maus, in ihr werden zeit- und gewebespezifisch Gene ausgeschaltet. So wird innerhalb dieses Praktikums auf die Methodik der Generierung gezielt mutagenisierter Mausstämme eingegangen. Auf den direkten Umgang mit den Tieren wird allerdings aus zeitlichen und ethischen Gründen verzichtet. Statt dessen wird exemplarisch mit einer Fibroblasten-Zelllinie gearbeitet.

2.) Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese:

2.1.) Zielsetzung und Methode:

Die genutzte Zelllinie stammt von Nierenzellen der grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops). Entscheidend für diesen Versuch ist, dass die Zellen genetisch verändert wurden, indem sie mit einem Transgen versehen wurden. Es handelt sich dabei um das lacZ Gen aus E. coli. Man nutzt in diesem Versuchsteil des Praktikum das Expressionsprodukt dieses Gens, die ß-Galaktosidase, als Nachweismethode. Das lacZ Gen ist Bestandteil des lac Operons. Dessen Genprodukte dienen dem Galaktoseabbau. Dieser erfolgt nur dann, wenn das lacZ Gen transkribiert wird. Nachgewiesen wird diese Reaktion über eine weiter Spaltung. Man gibt das farblose Substrat X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galaktosid) zu den Zellen. Ist in diesen die ß-Galaktosidase enthalten, wird X-Gal von ihr gespalten und es entsteht 5-Brom-4-Chlor-Indigo. Dies wird durch einen Farbumschlag zu Blau angezeigt. So kann mit dieser Färbung die Anwesenheit und Expression des lacZ-Gen nachgewiesen werden. Auf dem DNA-Strang der eukaryontischen Zellen liegt vor diesem lacZ-Gen das neo ^r -Gen. Dieses verleiht den Zellen die Resistenz gegen das Antibiotikum G418. In diesem Zusammenhang ist von Bedeutung, dass es die Expression des lacZ-Gen verhindert. Weiterhin wurde die DNA der Zellen genetisch verändert, indem ihr zwei sogenannte loxP-Stellen aus dem Bakteriophagen P1 eingebaut wurden. Diese loxP-Stellen flankieren das Resistenzgen. Grundlegend für diesen Versuch ist, dass die ebenfalls im Bakteriophagen P1 vorkommende cre Rekombinase die loxP-Stellen aus dem DNA-Doppelstrang ausschneiden kann.

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