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Versuch Nr. 1: Tomaten- und Kalbsbries-DNA Präparation Einleitung:

Das Erbgut höherer Organismen liegt im Zellkern in Form von Chromosomen vor. Um das Erbgut, die DNA, zu untersuchen und zu charakterisieren muss es isoliert und vom Rest der Zelle getrennt werden. Exemplarisch soll aus einem pflanzlichen (Tomate) und einem tierischen ( Kalbsbries) Organismus die DNA isoliert und sichtbar gemacht werden. Das methodische Prinzip, das diesem Isolierungsverfahren zugrunde liegt, ist auf alle Organismen anwendbar.

Das entsprechende Gewebe wird im kalten Zustand gemörsert oder zerkleinert, bis es pulverisiert ist. Zum Aufschluss der Zelle wird das Gewebe einem bestimmtem Puffer zugesetzt. Dieser Puffer sollte zellwandzerstörende Detergenzien wie SDS, welches an Proteine bindet und diese denaturiert und zellwandverdauenden Enzyme wie z.B. die Proteinase K. enthalten. Im Praktikum hat unsere Gruppe Zahnpasta der Marke Ajona benutzt, um den Gewebeaufschluss herbeizuführen. Nach einer Inkubationszeit erfolgen Reinigungsschritte mit organischen Lösungsmitteln, um Zellwandreste, sowie zelluläre Proteine zu entfernen. Um dies zu realisieren benutzt man Salze, deren positiv geladenen Ionen die negativ geladenen Phosphatgruppen des DNA-Rückgrats sättigen und Alkohol wie z.B. Ethanol. Ethanol fällt die DNA (Präzipitation). Ethanol macht die sehr langen, fadenförmigen DNA-Moleküle wasserunlöslich, indem es ihnen die umgebenden Wassermoleküle entzieht. Die DNA-Fäden lagern sich aneinander oder verknäulen sich und fallen als eine große, sichtbare Flocke aus. Die DNA befindet sich nun in einem festen Zustand und kann vom Rest der Lösung ( Zellbruchstücke, Proteine) getrennt werden. Die gefällte DNA kann darauf in Wasser resuspendiert werden und liegt nun konzentriert vor. Um Informationen über die DNA zu erlangen, wird diese einer Gelelektrophorese unterzogen. Aus den DNA-Fragmenten lassen sich dann Schlüsse ziehen, die in der Auswertung beschrieben werden. Durchführung: Tomaten-DNA-Präparation siehe Skript Kalbsbries-DNA-Präparation

Der Versuch wurde extra auf das schulischem Niveau konzipiert, womit gemeint ist, dass bestimmte Lösungen „vereinfacht“ wurden.

Benutzt wurde ein tiefgefrorenes Stück Kalbsbries (ca. 20 g), welches wir zunächst im gefrorenen Zustand mit einem Messer in kleine Stücke zerschnitten. Die erhaltenen Stücke wurden in ein Becherglas überführt und mit 100 ml Leitungswasser versetzt.

Durch Zugabe von ungefähr 20cm Zahnpasta ( Paste herausdrücken, Lineal daneben halten und 20 cm abschätzen) wird der Gewebeaufschluss erreicht.

Danach wurde die Lösung gut durchmischt. Dies kann mit einem elektrischen Pürierstab oder einem Mixer erfolgen. Es soll so lange püriert werden, bis keine Gewebefetzen mehr zu erkennen sind.

Nach einer Inkubationszeit bei 55°C für mindestens 30 Minuten im Wasserbad ( damit der Prozess beschleunigt wird und störende DNasen denaturieren) wurde der Ansatz mit weitern 25ml Wasser verdünnt, erneut gemixt und durch einen Faltenfilter (evtl. auch Kaffeefilter, ist jedoch nicht optimal) in ein 50 ml (Falcon)-Röhrchen filtriert.

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Da dies ein langwieriger Prozess war, erneuerten wir die Filter regelmäßig. Die erhaltene Lösung (5-10 ml) sollte relativ klar sein.

Nach Zugabe von 0,05g Kochsalz (NaCl) pro ml Lösung ( also: unsere Lösung betrug 15ml 15 · 0,05g = 0,75g) sollte die DNA gefällt werden.

Dies geschah in einigen Fällen mit 96%-igem Ethanol oder in anderen mit 80%igem Stroh Rum. Es sollten 2 Volumen des jeweiligen Alkohols dazu gegeben werden, was heißt, dass die doppelte Menge der DNA-Kochsalz-Lösung gemeint ist. Hierzu wurde der Alkohol langsam an der Innenseite des Gefäßes entlang auf die salzhaltige DNA-Lösung gegossen, so dass sich 2 sichtbare Phasen im (Falcon)-Röhrchen ergaben. Die DNA war bald darauf als wolkige, ausfallende Strukturen am oberen Teil des Röhrchens zu erkennen. Durch vorsichtiges ( damit die DNA nicht „zerfetzt“ oder „zerissen“ wird) Schwenken wurde die DNA als deutlich sichtbares „Wollknäul“ oder fädige Struktur erkannt. Mit einer Pipettenspitze entfernten wir einen Teil der ( ca. 10µl) DNA aus der Lösung und überführten diesen in ein Eppendorfgefäß, worin bereits 20 µl dH 2 O vorgelegt wurden. Das Präzipitat wurde mit der Pipette vorsichtig durchmischt und mit 4 µl Farbmarker versetzt auf ein Agarosegel (0.7-1.0%) aufgetragen.

Nach einer Wartezeit in der der Farbmarker 75% der Lauffont durchwandert hatte wurde das Gel , wie im dazugehörigen Protokoll beschieben, behandelt. Aus der Aufnahme kann man nun folgende Schlüsse ziehen. Auswertung: Tasche 1 2 3 4 5 6 7 8 Marker

Gruppe 1, 2 und 4 haben die DNA aus einer Tomate isoliert.

Gruppe 3 und 5 haben die DNA aus Kalbsbries isoliert.

Gruppe 1 und 3 haben jeweils zwei Taschen besetzt, da sie die Isolation zweimal durchgeführt haben. Einmal mit Rum und einmal mit 96%-igem Ethanol (Eth).

Das starke Signal (Leuchten),welches man in Spur 4 wahrnimmt liegt daran, dass die DNA beim pürieren zerrissen wurde. Dies bestätigt ebenfalls der Schmier, in dem keine Banden zu erkennen sind. So verursacht das Ethidiumbromid, das sich mit der DNA verbunden hat, dieses starke Leuchten. Ebenfalls abweichend von den anderen Gruppen ist das Leuchten der Tasche in Spur 4. Dies lässt Rückschlüsse darauf schließen, dass die DNA noch in der Tasche ist. Sie ist also nicht durch das Gel gelaufen. Der Grund dafür ist, dass ein Teil DNA zu groß war, um durch die Poren des Gels zu gelangen, da sie nicht von den Proteinen, die in jedem Chromosom vorzufinden sind und für die Verpackung des Erbgutes verantwortlich sind, isoliert wurden ist.

Die schwachen Signale der Spur 2 und 5 lassen die Erklärung zu, dass zu wenig DNA vorhanden war, womit sich das Ethidiumbromid hätte verbinden können. Dass DNA jedoch vorhanden ist, erkennt man an den sehr schwachen Banden in der Höhe von 12000 Bp in den beiden Spuren.

Das verwunderliche ist, dass jeweils in Gruppe 1 und 3 die Banden der mit Rum behandelten DNA besser zu erkennen sind. Da Rum nur 80% besitzt und Ethanol 96% sollte die Erwartung genau umgekehrt sein, da der Ethanol die DNA besser fällt. Dieses verkehrte Bild

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ließe sich aber mit der Erklärung begründen, dass, wie oben erwähnt, zu wenig DNA in den schwächern Banden vorlag.

Bei Gruppe 5 erkennt man in der Höhe von 12000 Bp gar keine Bande, obwohl alle anderen dort eine aufweisen können. Dies könnt daran liegen, dass unsere Gruppe beim „Herauspulen“ der DNA aus dem Falconröhrchen keine DNA erwischt hat. In der Höhe von 100 Bp erkennt man jedoch schwach eine Bande. Im Praktikum wurde darauf hingewiesen, dass dies rRNA sein könnte. RNA wandert schneller als DNA, da sie sehr klein und Einzelsträngig ist. Wenn dies der Fall ist, kann man behaupten, das Ethidiumbromid also auch an Einzelstränge bindet.

Geräte:

-Messer -Becherglas -Stabmixer oder Pürierstab -Falten- oder Kaffeefilter -Falconröhrchen -Eppendorfgefäße -automatische Pipetten -Elektrophorese-Apparatur -UV-Tisch mit Apparatur zum Fotografieren Benötigte Lösungen/Materialen: -Tomate oder Kalbsbries -Leitungswasser -Zahnpaste -Wasserbad (55°C) -Destiliertes Wasser -NaCl

-80%.iger Stroh-Rum oder 96%-iger Ethanol -Farbmarker -Agarosegel

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Versuch Nr. 2: Bakterientransformation, Plasmid- DNA Minipräparation und Restriktionsanalyse Einleitung:

Bakterien enthalten neben ihrer chromosomalen DNA noch zusätzliche kleine, ringförmige DNA-Moleküle (Plasmide), auf denen beispielsweise Gene für Antibiotikaresistenzen liegen. Plasmide sind ringförmige DNA Moleküle, welche unabhängig von der chromosomalen DNA in einem Organismus vermehrt werden. Sie enthalten eine als "origin of replication" bezeichnete Sequenz, an die zelluläre Proteine binden, welche die Verdopplung (Replikation) des Plasmids bewirken. Die Struktur des ORI bestimmt auch die Kopienzahl des Plasmids in der Zelle. Diese kann zwischen einer einzigen und etwa 100 variieren. Im ersten Fall spricht man von "low copy" im zweiten Fall von "high copy" Plasmiden. Bei der Zellteilung werden jeweils an beide Tochterzellen Kopien des Plasmids weitergegeben. Die Replikation der „low copy“- Plamside ist an den Replikationsmechanismus der Wirtszelle gebunden, wobei die Vertreter der „high copy“ die Fähigkeit besitzen sich autonom zu replizieren. Low-copy-number-Plasmid:

High-copy-number-Plasmid:

Um in der Zelle stabil zu bleiben und nicht abgebaut zu werden tragen die meisten Plasmide Gene, welche für Proteine kodieren, die für die Zelle lebenswichtig sind. Dies sind insbesondere solche Proteine, die Resistenzen gegenüber Antibiotika vermitteln. Einige Bakterienstämme besitzen die Fähigkeit, Plasmide an andere -, nicht plasmidhaltige Nachbar-Zellen weiterzugeben, um auch diese resistent gegenüber dem Antibiotikum werden zu lassen. Man unterscheidet die Episomen, welche sich in das Hauptchromosom eines Bakteriums einsowie ausgliedern können und zwischen Bakterien übertragbar sind, von den nichtmobilisierbaren Plasmiden, die dazu unfähig sind.

Ein weiteres Gen, dass auf einem Plasmid liegen kann, ist das lac z Gen auf welches ich später zu sprechen komme.

Die Größe der Plasmide variiert zwischen 2,5 bis 15 Kilobasen.

Plasmide ermöglichen horizontalen Gentransfer, dass heißt eine Übertragung des genetischen Materials ohne Kopulation zweier Organismen.

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Plasmide haben besondere Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die im Verlauf der Einleitung noch näher beschrieben werden.

Außerdem besitzen sie die Fähigkeit mehrere Kilobasen DNA ( Inserts) aufzunehmen. Diesen Abschnitt auf dem Plasmid, der hintereinander geschaltete Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme beherbergt, bezeichnet man als „multi cloning site“ oder „Polylinker“. Er befindet sich bei unserem Plasmid ( pBluescript II SK ) mitten im lacZ- Gen, was eine besondere Rolle spielt, um die Erfolge der Transformation zu bestätigen. Hierauf wird ebenfalls später weiter eingegangen. Wozu werden Plasmide eingesetzt?

1. Zur Klonierung von Bakterien

2. Plasmid- Vektoren sind wichtige Hilfsmittel der Molekularbiologie

3. In einen Plasmid- Vektor kann ein DNA-Fragment (z.B. ein Gen) eingebaut werden. Ziel: Vermehrung und Untersuchung des DNA-Fragments Bakterielle Plasmide gehören zu den Vektoren.

Vektoren sind DNA-Trägermolekül, mit denen fremde DNA-Fragmente in das Bakterium eingeschleust werden können. Sie liegen meist extrachromosomal vor und können Fremd-DNA aufnehmen. Vektoren sollten mit hoher Effizienz in die Wirtszelle einzubringen sein. Außerdem sollten sie möglichst viele Schnittstellen für Restriktionsenzyme besitzen. Vektoren müssten weiterhin über Selektions- und Rekombinationsmarker verfügen. Ein Vektor muss ebenso eine Expressionskontrolle besitzen.

Lambda- Phagen gehören ebenfalls zu den Vektoren. Sie besitzen gegenüber den Plasmiden folgende Vorteile.

In den Lambda- Phagen können sehr große DNA-Stücke (35-45 kB) eingebaut werden, da 40% des Phagengenoms ohne Verlust der Infektiösität entfernt und durch Fremd- DNA ersetzt werden können

Transfektionseffizienz (die Transfektion ist eine Methode zur Einschleusung heterologer DNA in Eukaryontenzellen )ist um Größenordnungen höher als Transformationseffizienz bei Plasmiden

Das Genom des Phagen Lambda besitzt 48502Bp. Er liegt als lineares Molekül vor. Im Bakterium ist er nicht extrachromosomal vorhanden, sondern ist in das Bakterienchromosom eingebaut.

Das allgemeine Verfahren zur Klonierung von DNA im Bakteriophagen Lambda beruht auf zwei Schlüsselmerkmalen des Bakteriophagen Lambda-Genoms:

• Etwa ein Drittel des Bakteriophagen Lambda-Genoms ist entbehrlich und kann durch Fremd- DNA ersetzt werden.

• DNA wird nur dann in infektiöse Phagenpartikel gepackt, wenn sie eine Länge von 40000 bis 50 00 Basenpaaren aufweist.

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Folgende Genbereiche können durch Fremdgene ersetzt werden:

- Gene für das lytische Wachstum

- Gene für die Rekombination

- Gene für die Integration

Die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme müssen künstlich eingeführt werden, da die lambda- DNA natürlicherweise keine Schnittstellen für Restriktionsenzyme besitzt (siehe Teil B der Abb.)

Cosmide enthalten vom ursprünglichen lambda- Genom nur noch die cos- Elemente einer Länge von wenigen Basenpaaren (siehe Teil C der Abb.), sowie das bla- Gen (beta-Lactamase) und den Replikationsursprung ori.

Der Lambda- Phage kann für den Aufbau genomischer oder cDNA Banken verwendet werden. Was sind Genbanken?

1. genomische Bibliothek

Setzt man die vielen Restriktionsfragmente in jeweils in Plasmid ein und überträgt diese Plasmide in jeweils ein Stammbakterium, so erhält man eine DNA-Bibliothek, die aus einer großen Anzahl verschiedener DNA-Restriktionsfragmente (bis zu einer Million) besteht. Dazu ist es allerdings notwendig, die entsprechenden Plasmide zu selektieren. Jede derartige Kolonie besteht aus einem Klon, der von einer einzigen Vorläuferzelle abstammt und enthält ein rekombiniertes Plasmid mit der gleichen eingebauten genomischen DNA-Sequenz. Man spricht von genomischer Bibliothek.

Ein Nachteil einer genomischen Bibliothek ist, dass die DNA-Fragmente rein nach dem Zufallsprinzip bzw. nach den passenden Schnittstellen für die verwendeten Restriktions-Enzyme zustande gekommen sind. Dass diese Fragmente auch Gene enthalten, ist aber nicht zwingend. Am meisten werden in diesen Fragmenten wohl nicht-codierende DNA-Abschnitte vorhanden sein, denn diese machen in vielen Genomen den größten Teil der DNA-Sequenzen aus. Um diesen Nachteil auszugleichen, legt man sog. cDNA- Bibliotheken an.

2. cDNA- Bibliotheken

Hierbei isoliert man die gesamte mRNA einer Zelle, damit man indirekt DNA-Sequenzen erhält, die für Gene codierten. Aus den gereinigten mRNA- Fraktionen stellt man die dazu