Inhaltsverzeichnis:

I)  Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens  

Einleitung   03

Materialien  und Methoden  03

Ergebnisse   03

Diskussion   05

II)  Versuch: Ortsspezifische Mutagenese  

Einleitung   08

Materialien  und Methoden  08

Ergebnisse   08

Diskussion   09

Literatur   10

   2

   2

I) Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens Einleitung

Im vorliegenden Versuch wird die Klonierung des Hefe-Gens sba1 erzielt.

Materialien und Methoden

Diese wurden wie beschrieben im Skript verwendet bzw. durchgeführt. Abweichungen vom Skript sind:

Bei der Zugabe von Lyticase wurde eine Endkonzentration von 40U/ml angesetzt statt 20U/ml [S. 6, 1.) Präparation von chromosomaler (genom.) DNA aus Hefe]. Bei der PCR mit (verdauter) genomischer Hefe DNA wurden 26 Zyklen statt 30 durchgeführt. [S.8, 3.) PCR mit (verdauter) genomischer Hefe DNA] Bei der AGE der PCR-cDNA-Fragmente wurde der Ansatz des eigenen, gereinigten und verdauten PCR-cDNA-Fragments (Ansatz 1) auf 2 Geltaschen verteilt, jeweils auf 25µl und 20µl. [S.10, 7.)Gelreinigung der PCR-cDNA-Fragmente, Agarosegelelektrophorese] Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Kontrolle von präpariertem Hefe-gDNA und die mittels PCR hergestellten cDNA-Fragmente in Agarosegel. Template für die PCR war entweder die im Versuch präparierte, genomische Hefen-gDNA (eigene gDNA) oder eine aus einer Firma fertiggekaufte Hefen-gDNA (gestellte gDNA).

Abb. 1: Gelfoto 1, Gelanalyse der

gDNA und PCR-cDNA. Kontrolle der Präparation von Hefe-gDNA mit unterschiedlichen Behandlungen (A-C) und

synthetisierten cDNA-Fragmente (D-F).

(0) Mass Ruler, Größenstandard.

(A) Aliquot 1 (gDNA, unverdaut). (B) Aliquot 2 (gDNA, SalI verdaut). (C) Aliquot 3 (gDNA, SalI verdaut, RNase A behandelt). (D) PCR-Ansatz 1 (eigene HefegDNA).

(E) PCR-Ansatz 2 (pos. Kontrolle: gestellte Hefe-gDNA). (F) PCR-Ansatz 3 (neg. Kontrolle: ohne gDNA-Template) 3   

Abbildung 2 zeigt die PCR-produzierten cDNA-Fragmente („eigene PCR-cDNA“ aus eigener gDNA und „gestellte PCR-cDNA“ aus gestellter gDNA) und das Plasmid pMPM 88B in Agarosegel. Beide wurden mit XhoI und BamHI verdaut.

Abb. 2: Gelfoto 2, mit XhoI und

BamHI verdaute Fragmente und Plasmid. 0: Mass Ruler

A1: eigene PCR-cDNA, 25µl (Insert)

A2: eigene PCR-cDNA, 20µl

(Insert)

B: gestellte PCR-cDNA

(+-Kontrolle)

C1: aus C2 übergelaufener Ansatz

C2: Plasmid pMPM 88B

25 µl und 20µ beziehen sich auf das

aufgetragene Ansatzvolumen in der

Geltasche.

Tabelle 1 zeigt die Anzahl an Kolonien der jeweiligen Transformationsansätze aller Kursteilnehmer.

Zahlen stellen meine Ergebnisse dar. Ansatz 1: eigene Vektor-DNA (pBS) mit eigenem cDNA-Fragment

(Insert). Ansatz 2: eigene Vektor-DNA (pBS) ohne cDNA-Fragment (Insert). Ansatz 3: eigene Vektor-DNA 4